NagiYoshitsugu
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11 months ago 概要
- ヒト細胞とマウス細胞をカフェインに暴露すると概日リズム周期が長くなることが分かった．
- SCNを含む脳スライスでは，位相遅れが生じた．
- in vivoで一週間カフェインを摂取すると，明暗条件下で肝時計の位相後退，暗条件下で周期が長くなることが分かった．
背景
- 哺乳類の概日リズムへのカフェインの影響は研究が不十分．
- 哺乳類の概日時計はSCNにおける中枢ペースメーカーと末梢の発振器からなる．環境入力として明暗サイクルと栄養摂取がある．
- カフェインについて，マウスの脳スライスにおいてリアノジン受容体を介した位相後退，ヒトにおいて夜間摂取でメラトニン濃度の抑制が知られている．
*リアノジン受容体
https://ja.wikipedia.org/wiki/%E3%83%AA%E3%82%A2%E3%83%8E%E3%82%B8%E3%83%B3%E5%8F%97%E5%AE%B9%E4%BD%93
興奮性の動物組織中でカルシウムチャネルの働きを持つ
手法
細胞ベースの概日リズムアッセイ
- U2OS-hPer2-Luc細胞（ヒト骨肉腫細胞）は上田先生寄贈．
- NIH 3T3-mBmal1-LucはpGL4.22ベクター（Promega）を恒常発現する，NIH 3T3-3-4細胞（マウス線維芽細胞 / CELL BANK）から樹立した．
- 細胞株は，DMEM（10%仔牛胎児結成（MP Biomedicals）・ペニシリン-ストレプトマイシン（Sigma）添加，high-Glucose（Invitrogen））中，5%CO2雰囲気，37℃で培養．
- 50%ウマ血清2時間刺激でリズムをリセット．
- 0.1 mMルシフェリン（Promega）とカフェインを添加して35 mmディッシュでインキュベート．
- 発光はKronos Dio AB-2500; ATTOで計測．
動物の取り扱い
- ここでは省略，原著を確認してください．
Per2::Lucマウスからの摘出株の調製と発光の測定
- 肝時計 / 位相後退の実験 - 肝臓摘出片の調製は[14]の通り https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006909 - ZT3で肝臓を摘出，HBSS（= Hank's balanced salt salution / 10 mMHEPESとペニシリン-ストレプトマイシンを添加）に入れる． - 35 mmディッシュに入れて，パラフィルムで密閉，DMEM（10 mM HEPS・ペニシリン-ストレプトマイシンを含む，high-glucose），5% CO2，37℃で培養． - Kronosルミノメータで10分間隔で1分モニター．
- SCN / 位相後退の実験
- 調整方法は[15]の通り
https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.22-01-00350.2002
- ZT6で脳を摘出，HBSSに入れた．
- ビブラトームを用いて組織切片を作成．
*ビブラトーム
https://www.leicabiosystems.com/sites/default/files/media_product-download/2021-04/210136_Vibratome_Series_Brochures_JP.pdf
凍結や包埋せずに組織切片を作成する技術．
- ミリセルメンブレン，1.3 ml DMEM（containing 4.5 g/l glucose, 0.35 g/l NaHCO3, 1B27 supplement (Invitrogen), 10 mM HEPES, penicillin–streptomycin and 0.1 mM luciferin），CO2なし，37℃でインキュベート
- Kronosルミノメータで発光をモニター
発光データ解析
- 解析手法は[14, 15]のとおり
- 平滑化・トレンド除去後，ピーク検出．
- 培養12 h - 36 hのピークから，周期長を算出した．
行動分析
- 行動分析は[16]のとおり． https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2010.09.072
- BALBマウスに赤外線センサー（AS10D; Melquest）を装着．CIF-IIソフトウェアで運動量データを収集・解析した．
- その後，①caffeine (0.04% or 0.08%), ②coffee (1 g of instant coffee/100 ml water), ③decaffeinated coffee (1 g/100 ml water)，④waterを1週間暗条件下で与えて，フリーラン機関を測定した．
- ケージに回し車（SW-15S; Melquest）を装備し，2週間明暗サイクル下，2週間暗条件下，食餌は自由．
統計解析
- 一重検定ではステューデントのt検定，多重検定ではpost hoc検定における一元配置分散分析を採用．
- カフェイン量依存性はGraphPad ソフトウェアを使用．
結果
カフェインが哺乳類細胞の周期を延長
Fig. 1 カフェインが哺乳類細胞の周期を延長 (A - C) ヒト骨肉腫細胞U2OS/hPer2-Luc細胞 (D - F) マウス線維芽細胞NIH3T3/mBmal1-Luc細胞 (A, D) 発光の生データ (B, E) 生データから平滑化・トレンド除去 (C, F) カフェイン量と周期長の関係
カフェインでマウスの肝時計の周期伸長
Fig. 2 (A, D, E, F) 肝細胞の発光データ (B) 培養下 / コントロール OR カフェイン添加 / 12-36 hでのピークのCT (C) 培養下 / コントロール OR カフェイン添加 / 12-36 hでの周期の長さ (D, G) 水とカフェイン摂取の比較 (E, H) 水とコーヒー摂取の比較 (F, I) 水とデカフェコーピー摂取の比較
- カフェインによって周期伸長するものの，位相後退はなかった．
カフェイン投与でマウスSCNが位相後退
Fig. 3 マウスSCNでのカフェインの影響（Per2-Lucマウス/ SCN） (A) 発光の生データ (B) 平滑化・トレンド除去処理後 (C) 培養下 / コントロール OR カフェイン添加 / 12-36 hでのピークのCT (D) 培養下 / コントロール OR カフェイン添加 / 12-36 hでの周期の長さ
カフェイン摂取で概日行動周期が伸長
Fig. 4 カフェイン摂取で概日行動周期が伸長 DD条件下で，①caffeine (0.04% or 0.08%), ②coffee (1 g of instant coffee/100 ml water), ③decaffeinated coffee (1 g/100 ml water)，④waterを1週間摂取 (A) DD下でのアクトグラム，灰色がLD条件時のL・黒色がLD条件時のD (B) カフェイン摂取と行動周期の関係 (C) 2週間LD・2週間DD下でのアクトグラム，灰色がLD条件時のL・黒色がLD条件時のD (D) カフェイン摂取と行動周期の関係
考察
- マウスSCNではカフェイン刺激に対して，周期伸長はなく，位相後退が見られた．中枢の位相後退によって，末梢の周期伸長が起こる可能性がある．
- 概日時計の構成要素やプロセスは種特異的だが，カフェインが種に限らず周期伸長を引き起こすことから，カフェインの作用メカニズムは一元的なメカニズムであることが示唆される．
- カフェインは様々なアデノシン関連酵素を阻害することが知られており，ATP反応がカフェインの概日リズムへの影響に関与している可能性がある．
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