空间多组学DSP构建肺癌组织地图

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空间多组学DSP构建肺癌组织地图 by 生信人

前言

空间转录组（ST-seq）结合成像和测序技术，能够识别空间原位组织不同区域内基因表达情况，直观揭示肿瘤生态系统异质性。空间蛋白组是基于抗体对多种蛋白质进行空间定向评估，可以发现特定蛋白在不同区域的表达差异。两种技术结合的DSP除了能检测正在表达的基因外，还允许研究人员分析不同细胞群体之间的差异，该项技术有助于解答特定组织中基因和蛋白表达的时间、地点和数量的相关问题。

今天给大家分享一篇今年2月11日发表在Journal for ImmunoTherapy of Cancer（IF=10.9）杂志上的文章，该研究利用NanoString GeoMx Digital Spatial Profiler （GeoMx DSP）空间多组学平台分析aNSCLC患者不同空间位置和不同疗效组的转录组和蛋白质组信息，发现跟双特异性抗体治疗晚期NSCLC（aNSCLC）患者疗效相关生物标志物。

          

         

一、背景

免疫检查点抑制剂治疗aNSCLC取得很好疗效的同时，只有小部分患者获益，其中肿瘤内部异质性（ITH）是导致疗效差异的原因之一。从空间分辨率多组学水平构建组织地图解析肿瘤生态系统异质性，比传统批量RNA和蛋白测序更加清晰，同时比单细胞转录组测序能检测到更多的基因，更有利于临床预后生物标志物的开发。为了在aNSCLC患者的多组学空间水平上探索ITH，本研究利用GeoMx DSP的分割策略，结合NGS和NanoString nCounter分析系统，在蛋白质组和转录组水平上获得肿瘤和基质区域的差异信息。基于ITH的考虑，利用不同区域候选蛋白构建的signature来预测免疫治疗的疗效。

         

KN046是江苏康宁杰瑞（Alphamab Oncology）公司开发的一种双特异性抗体（bsAb），靶向程序性死亡配体-1 （PD-L1）和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4 （CTLA4）。KN046在aNSCLC患者中的安全性和临床有效性在一项II期多中心临床试验中进行了评估。与抗PD-1/PD-L1单药治疗的历史数据相比，中位无进展生存期（mPFS）显示出有利的优势。

         

NanoString GeoMx Digital Spatial Profiler （GeoMx DSP） 是NanoString公司联合MD安德森等多家研究单位共同开发的一项基于光学与探针技术的多组学技术平台。它可以在同一临床样本中一次性测定上百种蛋白质，或者1833个癌症相关靶标的转录组，又或者超过18000个靶标的全转录组，将组织病理学、肿瘤免疫与表达谱相结合，在肿瘤微环境研究、肿瘤异质性与肿瘤免疫研究中有着强大的优势。NanoString的nCounter 通过独有的荧光条形码捕获技术，在最常见的临床样品类型如石蜡包埋（FFPE）以及新鲜冷冻样本中检测基因表达，具有很高的灵敏度。

         

二、研究方案及技术细节

1.患者入组

本研究纳入18名接受双特异性抗体（bsAb）-KN046治疗的NSCLC患者，入组标准为18-75岁、经组织学或病理学证实的IV期NSCLC、表皮生长因子受体突变阴性（EGFR无突变）或间变性淋巴瘤激酶重排（ALK重排）、以及一线铂类化疗失败或不耐受的患者。所有患者参加了一项II期多中心临床试验，选用上海肺科医院中心现有的组织。患者每14天静脉注射一次bsAb-KN046，直至疾病进展或出现无法耐受的毒性（图 1A）。根据RECIST v.11标准评估肿瘤应答。为了满足DSP的要求，对样品进行了DSP蛋白测定和DSP RNA测定。

图1.空间异质性研究方法概述

         

2.样本制备

nanostring GeoMx DSP protein和RNA分别进行样本制备，实验处理步骤相似，细节处理有所不同。

将4um FFPE载玻片经脱蜡复水、标准抗原修复等一系列实验处理后，与UV可裂解oligo标签抗体或RNA探针、形态标记PANCK和CD45及核染色SKTO13混合物进行共同孵育，荧光标记的抗体主要用于成像辅助ROI选择，Oligo标签标记的RNA探针or抗体主要用于定量。最后，载玻片被加载到GeoMx仪器上。

         

3.DSP

为了测量mRNA的表达，使用了癌症转录组图谱（CTA）Panel，该Panel旨在以空间分辨率同时分析1812个基因，对肿瘤和肿瘤微环境数百种生物学至关重要的特征进行分类。为了测量蛋白质表达，使用GeoMx DSP 的4个蛋白Panels: Immune Cell Profiling Core，Pan-Tumor Module， Immune Cell Typing Module和IO Drug Target Module，共包括44个蛋白质和6个内参。

         

• 圈选ROI（Region of Interest）

为了选择ROIs，本文用形态学标记（上皮细胞标记物panCK、白细胞标记物CD45和核染色SYTO13）对FFPE组织切片进行染色，以分析肿瘤和基质细胞。每个切片根据染色模式和位置特征平均选取6个ROIs。由于每个ROI内的细胞异质性，很难将目标细胞（如肿瘤细胞或免疫细胞）的mRNA和蛋白质表达信号从其周围细胞中分离出来。因此，如果采用所有ROI进行分析，则复杂的异质性被掩盖。为了解决这一问题，将形态学标记的染色模式与数字光学条形码技术相结合，使用掩蔽和分割策略将肿瘤或基质细胞与其周围细胞分离，从而能够解剖肿瘤细胞与其微环境之间的对话机制（图1C）。这样，ROIs进一步细分为肿瘤和基质AOIs（Area of Interest）。在20例样本中共获得206个AOIs（肿瘤：136个，基质：70个）。其中150个AOIs和56个AOIs分别进行了DSP蛋白和DSP RNA检测（图1D）。

         

• 定量

在免疫荧光图像上进行感兴趣区（ROI）选择，从序列掩模中将特定间隔感兴趣区（AOI）分配为基质（panCK染色阴性和肿瘤逆转段）和肿瘤（panCK染色阳性和肿瘤富集段）间隔。每个ROI由两位上海肺科医院病理科的病理学家独立选择。每个样本选择1-17范围内的ROI进行分析。使用GeoMx DSP仪器（NanoString）对每个AOI空间索引条形码进行切割和收集。

对于蛋白定量，加载到nCounter FLEX （NanoString）上，对GeoMx DSP收集的寡核苷酸进行计数，完成后得到RCC（reporter code count）文件。

对于RNA定量，收集barcode经PCR扩增，在GeoMx Seq Code primers上添加i5和i7索引序列。PCR产物纯化、质量评估、定量后在Illumina NextSeq 550AR仪器上测序。一旦测序完成，FASTQ文件被转换为数字计数转换（DCC:digital count conversion）文件。

对圈选AOIs区域内蛋白表达跟基因表达相关性评估结果显示，所有AOIs或者肿瘤AOIs或基质AOIs内蛋白和基因表达都是中等正相关，表明具有一致性和可比性（图1E-G）。将RCC/DCC文件上传到GeoMx DSP系统，将计数与空间数据进行整合，然后进行数据分析。

         

4.数据分析

DSP数据分析是一个基于服务端的交互式分析系统，根据研究目的不同，开展不同的个性化分析。

         

• 空间蛋白组

RCC文件上传至GeoMx DSP系统后，使用Data Analysis模块 V.2.4.0.421分析。使用nCounter测定进行蛋白质数据的质量控制 （QC），其中包括六个阳性对照探针和六个阴性对照探针。对于每个AOI，FOV（field of view）检测百分比>=75%，结合密度在0.1至2.25之间，核计数>20，表面积>1600平方微米，来自特定探针对应的条形码的原始数字计数被归一化。通过面积归一化和不同的细胞数量来调整不同ROIs的大小，以避免ROIs之间的差异。符合QC标准的数据根据样本间背景IgG表达进行标准化。

标准化计数用于比较组间差异，并构建泛肿瘤、免疫细胞谱、免疫细胞分型和IO药物与相应蛋白的特征。signature score通过如下公式计算：

其中Xi是每个蛋白质的标准化表达值，n是特征中包含的蛋白质数量。采用Wilcoxon检验分析组间差异，以p值<0.05为差异显着性。对于每个样本中相应蛋白的模拟批量测序数据，通过公式（X1+X2…+Xn） /N（N是每个样本中对应AOI的数量）计算每个样本中所有AOI、基质AOI和肿瘤AOI的蛋白表达量。

         

• 空间转录组

使用软件GeoMx NGS Pipeline V2.0.0.16将FASTQ文件转换为DCC文件，然后将 DCC文件上传到GeoMx DSP系统使用Data Analysis V.2.4.0.421模块分析。转录组数据的QC包括技术信号、技术背景、探针和标准化。对于技术信号QC，如果ROI内reads与模板序列的比对率<80%则移除。技术背景QC，包括无模板对照（NTC）计数、阴性探针计数和ROI参数。NTC计数用于检测文库构建过程中的模板污染，NTC>1000的ROIs被移除。阴性探针计数用于测量CTA实验中的整体技术信号水平。阴性探针计数的阈值是四次计数。ROI参数包括核数 （>100）和表面积 （>8000平方微米）。通过面积归一化和不同的细胞数量来调整不同ROIs的大小，以避免ROIs之间的差异。对于符合QC的ROIs，使用样本四分之三分位数进行标准化。

基因表达矩阵用于比较组之间的差异并计算不同的特征分值，包括细胞功能、免疫应答、代谢和信号通路。14个免疫细胞特征分数由SpatialDecon V.1.2.0计算，该软件使用反卷积来估计TME中免疫细胞和基质细胞的数量。其它特征分数跟蛋白用到的公式一样。通过edgeR 3.34.0包中参数“min.count=3”的“filterByExpr”函数来去除低表达基因，使用默认参数来识别差异表达基因（DEG），包括函数glmFit、glmLRT、estimateGLMCommonDisp、estimateGLMTrendDisp和estimateGLMTagwiseDisp，差异表达筛选条件为|log2FoldChange|>1和FDR<0.05，得到的显著差异表达基因用网页工具KOBAS-i进行GO和KEGG功能富集分析。每个样本中相应RNA的模拟批量测序数据，通过公式（X1+X2…+Xn）/N（N为每个样本中对应AOIs的数量）来计算样本所有AOIs、基质AOIs和肿瘤AOIs的RNA表达值。

         

5.临床预后分子特征构建及验证

用免疫治疗有应答和无应答组之间所有显著差异表达蛋白质的算术平均值来定义分子特征，[Σ（log2（Xi+1））−Σ（log2（Yk+1））]/N，其中Xi是应答组中蛋白归一化表达值，Yk为无应答组中蛋白的归一化表达值，N为该分子特征中包含的蛋白数量。

         

为了验证该特征分值的预测准确性，下载文献中65名经ICIs治疗的NSCLC患者原始数据，Trim galore V.0.6.7过滤低质量reads和adapter，Kallisto V.0.46.2计算表达TPM值，参考转录组版本是Gencode V.38。通过公式[Σ（log2（Xi+1））-Σ（log2（Yk+1））]/N计算预后特征分值，以中位分数作为阈值将患者分为高分组和低分组，完全缓解（CR）和部分缓解（PR）归为有应答组，疾病稳定（SD）和疾病进展（PD）归为无应答组。

         

6.多重免疫组化（mIHC）

mIHC对4μm FFPE全组织切片进行染色，选择了与DSP一致的panCK作为标记来区分肿瘤区域和基质区域， panCK的阳性区域被定义为肿瘤区域，而阴性区域被定义为基质区域。

         

7.PD-L1定量检测

通过DSP protocol和传统自动IHC进行PD-L1定量检测，IHC是根据着色比例进行定量，即肿瘤比例分值（TPS）来判断PD-L1阳性，TPS=（PD-L1膜染色阳性肿瘤细胞数/肿瘤细胞总数）×100%，TPS<1%为阴性；1%～49%为弱阳性；≥50%为强阳。

         

8.TMB计算

TMB是基于泛生子825个癌症相关基因大Panel（平均深度>700x）计算的，TMB=非同义突变数量/panel大小（mut/Mb）。具体实验操作流程为：从FFPE标本中提取肿瘤标本进行DNA分离和基因组DNA测序，用KAPA Hyper Prep试剂盒构建DNA文库。将所制备的文库与两种不同的杂交剂和阻断剂在SureSelectXT靶浓缩系统中进行杂交。用P5/P7引物对文库进行扩增。最后，用2200生物分析仪鉴定后，在NovaSeq6000平台（Illumina）上对文库进行测序，并用Qbit3和RT PCR试剂盒对NGS文库进行定量。

         

9.绘图及统计

热图基于R包ComplexHeatmap绘制，R包umap进行降维分析；Wilcoxon秩和检验比较两组之间的表达差异；Pearson相关系数进行相关分析；ROC曲线用于评估模型的预测能力，使用R包pROC计算曲线下面积 （AUC）以测量辨别能力。Kaplan-Meier （KM） 曲线分析来分析OS和PFS的显著差异，log-rank检验比较KM曲线差异。使用反向KM方法计算中位随访时间。效应大小表示为95% CI的标准差。p值<0.05时具有统计显著性。

         

三、研究成果

1.肿瘤内空间AOIs的独特表达模式

同一样品的肿瘤AOIs与基质AOIs在蛋白质和RNA水平上存在显著差异（图2A），使用降维分析可以更清楚地观察到这种不同的表达模式（图2B）。大部分患者的DSP蛋白结果显示肿瘤AOIs和基质AOIs独立聚集为两类，也有特别的患者P6和P9的肿瘤和基质AOIs聚集在一起（图2A）。

         

通过DSP研究与肿瘤和基质区相关的特定蛋白分子标记，与肿瘤表型最相关的蛋白标志物是上皮细胞粘附分子（EPCAM）、人表皮生长因子受体2（ERBB2）和Ki-67。免疫细胞标记物（CD45），包括T细胞标记物（CD3、CD8和CD4）和树突状细胞（DC） （CD11c）在基质区显著升高（图2C、D）。与基于蛋白Panel的研究结果一致，免疫细胞表达和免疫细胞分型的特征评分在间质AOIs中显著较高，而泛肿瘤特征评分在肿瘤AOIs中显著较高（图2E、F）。

         

根据肿瘤的进化过程，空间相邻的肿瘤区域在分子水平上会有更高的相似性。在12个肿瘤样本中选取具有明确空间距离的AOIs进行分析，结果发现其中8个肿瘤AOIs的空间距离与分子聚类模式一致（图2G）。P7中空间封闭的肿瘤AOIs（06-07、04-08和03-09）在RNA表达水平聚集在一起；P1中一对空间距离相对较近的肿瘤AOIs（06-07），它们的蛋白表达模式聚集在一起。此外，通过分子聚类推断不同区域之间的关系可能反映肿瘤发展的路径。P2的5个地理不同区域（01-05）的聚类结果可以推测肿瘤的发展可能起源于AOI 02和03，并且在基质AOIs中也观察到类似的现象（图2G）。

从相同ROIs分割的肿瘤和基质区域之间的相关性显着高于不同ROIs之间的相关性，且肿瘤AOIs之间的相关性在蛋白质和RNA水平上最强（图2H）。

图2.肿瘤内AOIs的不同表达模式

         

2.肿瘤和基质AOIs中免疫细胞类型和通路特征

肿瘤AOIs中淋巴细胞丰度显着低于基质AOIs（图 3A），而巨噬细胞、CD4 T细胞、成纤维细胞、单核细胞、B细胞和CD8 T细胞是基质AOIs中检测到最多的细胞类型（图 3B）。对不同区域之间免疫应答相关特征分析发现，淋巴细胞运输和淋巴细胞调节特征评分与基质AOIs相关，基质AOIs中的白细胞介素2（IL2）信号传导、II 型干扰素和吞噬作用特征评分显着较高，而肿瘤AOIs 中的IL-1和IL-17特征显着较高。

通过分析每位患者体内AOIs表达模式揭示与癌症相关的细胞功能、信号传导途径和代谢异常。76.3%的癌症相关特征在肿瘤AOIs的评分都高于基质AOIs，比如与增殖和转移相关的细胞功能和信号通路特征显着增加（图3C），这与肿瘤细胞无限增殖和转移的能力一致。在肿瘤区域，细胞的正常功能经常失调（图3D）。肿瘤AOIs 中与能量代谢和大分子合成相关的通路评分也显着较高，这与肿瘤细胞的快速增殖需要更多能量和生物大分子的观察结果一致（图 3D）。

图3. 肿瘤和基质AOIs中免疫细胞类型和癌变途径相关特征

         

3.DSP标记鉴定揭示ITH对寻找疗效相关候选生物标记物的影响

为了评估ITH对治疗效果的影响，采用DSP数据探寻bsAb-KN046治疗的疗效。在基质区和肿瘤区分别鉴定出18个和11个与疗效相关的DSP蛋白标记物（图4A和4B），而使用模拟的Bulk测序数据仅鉴定出4种蛋白（图4C）。为了进一步验证蛋白在不同区域的表达情况，我们选取基质区常见的CD11c、Tim-3、CD45、CD4等4种蛋白进行mIHC检测。与DSP肿瘤区和基质区的定义一致，panCK阳性区域定义为肿瘤区，阴性区域定义为基质区。我们计算每种标记物阳性的细胞比例。PR组基质区上述4种蛋白质的比例均显著高于PD组（图4D）。此外，我们通过DSP发现肿瘤和免疫标志物之间的相关性是可区分的，提示肿瘤和免疫细胞群对治疗效果的不同作用（图4E）。随后，我们评估了不同应答组患者基质区免疫浸润情况，发现PR组CD4 T细胞、DC、巨噬细胞和单核细胞四种免疫细胞的丰度明显高于PD组，但通过模拟Bulk测序数据只能识别CD4 T细胞和DC（图4F）。同时，PR患者基质区的免疫细胞表达特征（immune cell profiling）、免疫细胞分型（immune cell typing）、肿瘤免疫靶药（IO drug）和泛肿瘤（pan-tumor）等特征分值（signature scores）以及肿瘤区域的免疫细胞分型特征评分均显著高于PD患者，而在模拟的Bulk数据中均未观察到这些现象（图4G）。

图4. DSP标记物的鉴定揭示了ITH对治疗效果的影响

         

4.空间分辨率上的基质区域比肿瘤区域具有更大的临床应答相关性

对疗效相关的DSP蛋白标记物（肿瘤区域蛋白质标记物：OX40L、Bcl-2、B7-H3、CD45RO、GITR、CD34、PTEN、孕激素受体（PR）、CD14、STING和PD-L1；间质区域的蛋白质标记物：B7-H3、Bcl-2、B2M、CD11c、CD14、CD4、CD45、CD45RO、FAP-α、GITR、MART1、OX40L、PD-L1、孕激素受体（PR）、PTEN、TIM-3、VISTA和4-1BB）计算空间分辨特征分数。PD患者和PR患者在肿瘤和基质区域的Signature评分均有显著差异（图5A，B）。

         

为了进一步探讨基质和肿瘤特征在预测KN046疗效中的作用，采用多因素COX回归分析了年龄、性别、吸烟史、ECOG status、病理分类、PD-L1表达和应答特征对ROIs临床预后的影响。与肿瘤特征和传统生物标志物（如PD-L1和TMB）相比，来自基质的特征显示出更强的临床相关性（图5C）。此外，基质特征评分高的患者的中位OS比评分低的患者长，但mPFS没有达到统计学意义（p=0.078）（图5D，E）。

         

从公共数据集中下载65名经ICIs治疗的NSCLC患者数据，以确定基质区域的标记是否仍然有效地预测一般免疫治疗的疗效。研究发现，在验证数据集中应答组的基因特征分数显著增加（图5F）。用于预测临床应答的空间分辨特征的AUC值为0.776（图5G）。高特征分数组的PFS和OS显著长于低分数组（图5H，I）。以上结果表明，来自基质区域的分子可能在评估免疫治疗的临床疗效方面具有更大的潜力。

         

图5. 构建空间分辨特征以预测对免疫治疗的临床应答

         

四、总结

本研究通过数字空间分析技术DSP，结合下一代测序（NGS）和nCounter分析系统，从NSCLC样本的空间不同区域量化肿瘤和基质区的RNA和蛋白质表达，并对使用KN046治疗不同疗效组的患者进行了多组学分析。研究发现来自同一肿瘤样本的肿瘤和基质区表现出不同的特征；从肿瘤或基质区识别出多个与治疗反应相关的蛋白，其中大多数无法通过模拟Bulk测序识别。比较基质区和肿瘤区差异蛋白构建的空间分辨Signature预测免疫治疗临床反应的能力，发现基质区域的Signature对治疗反应具有更强的预测能力，这也对未来免疫治疗疗效相关生物标志物的探索提供了新的思路。

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