经典104！这篇免疫检查点研究，用CRISPR文库筛选，流程规范，表型好玩，值得借鉴！

经典104！这篇免疫检查点研究，用CRISPR文库筛选，流程规范，表型好玩，值得借鉴！ by 芒果师兄聊科研

一篇顶百篇！这篇趋化因子研究，从生信到实验，从免疫到表观，从逃逸到靶点，每一步都能借鉴~~

2024-05-18

一篇顶百篇！这篇免疫检查点研究，从表型到机制，从功能到治疗，值得借鉴！

2024-07-01

一篇顶百篇！这篇陈列平团队的研究！从筛选到鉴定，从表型到机制和治疗，科学严谨，值得借鉴！

2024-07-23

无论做生信分析，还是做科研实验，最重要的是落实到论文发表上。我们认为，仅仅是纯生信分析甚至包括 R 等还不足以支撑我们认识疾病的本质，我们还需要掌握实验技能，阅读最前沿的文献，以获得概念性的知识，提升个人认知。我们的策略是用读一百篇论文的时间把一篇文献读透彻，真正学会，学以致用，提升思维、作图和写作。前三篇推文（101-103）围绕 T 细胞展开！这次，我们介绍跟吞噬细胞相关的文库筛选研究。

CRISPR/Cas9技术已是实验室常规技能。一般有三种用途，一是单基因敲除，这个最常见；二是用sgRNA library进行全基因敲除，主要用来高通量筛选；三是基因定点插入。其原理是Cas9/gRNA复合物在靶位点进行精准剪切，产生双链断裂缺口Double-strand break（DSB），细胞通过非同源末端连接nonhomologous DNA end joining（NHEJ）或者同源重组homology-directed repair（HDR）方式对断裂双链进行修复，造成靶位点的插入/缺失突变，从而达到Gain-of-function或Loss-of-function的效果。

2012年8月，詹妮弗・杜德娜和埃玛纽埃尔・卡彭蒂耶合作，在Science发表论文，首次解析CRISPR/Cas9的原理；2013年2月，张锋在Science发表论文，首次将CRISPR/Cas9应用于哺乳动物和人类细胞。由此，CRISPR/Cas9三大巨头诞生了——詹妮弗・杜德娜、埃玛纽埃尔・卡彭蒂耶和张锋。2020年，前两位已获得诺贝尔奖。

他们分别创立了公司，张锋创立了Editas Medicine，詹妮弗・杜德娜创立了Intellia Therapeutics，埃玛纽埃尔・卡彭蒂耶创立了CRISPR Therapeutics。三家公司在遗传病领域发力，并取得许多突破。目前，基于CRISPR的全基因组文库筛选技术得到广泛应用。一篇顶百篇系列的第四篇文献（文献104），我们分享来自斯坦福大学医学院的Michael C. Bassik教授团队2021年在Nature杂志发表的题为Inter-cellular CRISPR screens reveal regulators of cancer cell phagocytosis的研究论文。

针对肿瘤的单克隆抗体疗法在很大程度上是通过触发巨噬细胞的吞噬左右来驱动肿瘤细胞的清除。然而，尽管存在经典的CD47/SIRPα，以及CD24/siglec10、PD-L1/PD-1和MHC-I/LILRB1等“别吃我”信号通路，但是肿瘤细胞逃逸吞噬作用的机制尚不完全清楚。该论文通过双筛选系统，全面地探究了肿瘤逃逸吞噬细胞的分子机制。

为了全面探究参与ADCP过程的分子，研究人员通过全基因组CRISPR文库敲除的Ramos B淋巴瘤细胞，并借助巨噬细胞的抗体依赖性杀伤作用ADCC（图1a），筛选参与肿瘤细胞逃逸细胞吞噬的基因，得到经典的抗吞噬基因CD47、CD47修饰酶QPCTL和几种唾液液酸合成酶，这些基因可保护肿瘤细胞免受吞噬细胞杀伤。除了已知的调节基因，还发现许多未知基因，包括脂肪细胞质膜相关蛋白（APMAP）（图1b）。

CD20抗体处理可诱发吞噬细胞ADCP吞噬作用

为了确保实验的全面性，研究人员还使用CRISPR激活系统筛选来发现Ramos细胞中未内源高水平表达的、可能参与ADCP的其他调节基因（图1c），并筛选得到大量抗吞噬和促吞噬的靶基因（图1d）。针对CRISPR激活系统筛选的抗吞噬基因进行GO富集分析，以及CRISPR敲除和CRISPR激活筛选的靶基因进行分析（图1e），发现上述基因在唾液酸生物合成和蛋白唾液酸化通路上高度富集。值得注意，得分较高的癌基因（GFI1和MUC12）、癌抗原（例如MUC1和LRRC15）、转移驱动因素（例如MUC21、PODXL和SMAGP）或肿瘤阴性预后指标（例如C5AR1），但其在肿瘤发生中的作用尚不清楚。

通过培养特异性sgRNA激活的弗罗多红染料标记的Ramos CRISPRa细胞，并将其与吞噬细胞共孵育，进行ADCP实验，并监测靶细胞内化和酸化后红色荧光的时间依赖性增加，以分析每个潜在靶基因在肿瘤逃逸巨噬细胞吞噬中的作用。实验发现，其中9个基因作为ADCP易感性的调节因子（图1f）。SMAGP编码一种特征很差的细胞表面糖蛋白，并且是CRISPRa筛选中最显著的基因之一。

作者发现SMAGP在结肠癌细胞RKO中高表达，且逃逸吞噬细胞的ADCP作用；但SMAGP的缺失却使得RKO细胞在抗CD47抗体的情况下对吞噬作用高度敏感（图1g）。因此，CRISPRa筛选能够识别仅在一部分细胞系中高水平表达的抗吞噬基因。为了确定上述基因高表达影响的抗体依赖性吞噬的阶段，作者开发了一种基于成像的细胞粘附试验，通过用细胞松弛素D抑制肌动蛋白聚合来评估在没有吞噬情况下的靶细胞结合（图1h）。作者发现粘蛋白MUC1、MUC12和MUC21的高表达阻止巨噬细胞在利妥昔单抗存在的情况下与Ramos靶细胞结合，这与报道的粘蛋白高表达可封闭肿瘤细胞表面的能力一致（图1h）。

大多数基因的高表达降低了抗CD20和抗CD45与细胞表面的结合，而编码转录阻遏物GFI1高表达则降低了抗CD20结合。但是，包括SMAGP和ST6GALNAC1在内的多个基因高表达并不影响靶细胞与巨噬细胞结合或降低抗体结合（图1h）。因此，该筛选体系确定了多个肿瘤逃逸ADCP相关的基因。

在Ramos CRISPR基因敲除筛选（图1b）和用抗CD30抗体在Karpas-299 T 淋巴瘤细胞中进行的第二次全基因组ADCP筛选（图1i）中，APMAP是吞噬敏感最强的修饰因子之一，提示APMAP在肿瘤逃避吞噬作用中发挥重要作用。APMAP在人类组织和CCLE细胞系中普遍表达，并在几种恶性肿瘤中高表达。在抗CD20和巨噬细胞存在情况下，APMAP敲除的Ramos细胞对ADCP显著致敏，甚至比CD47敲除的细胞更敏感（图1j）。