解密心脏纤维化：揭示单细胞转录组学的新前沿

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解密心脏纤维化：揭示单细胞转录组学的新前沿 by 生信方舟

写在开始：“人生到处应何似，应似飞鸿踏雪泥”（别着急划走，文末有干货哦）

《Integration mapping of cardiac fibroblast single-cell transcriptomes elucidates cellular principles of fibrosis in diverse pathologies》，该文章发表在《Science Advances》杂志上，发表时间是2024年6月2日。PMID: 38905342 /DOI: 10.1126/sciadv.adk8501

链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC11192082/

一、引言：
心脏纤维化是多种心血管疾病的核心病理变化之一，涉及到心脏组织中的成纤维细胞异常增殖和胶原沉积，最终导致心脏功能受损。随着单细胞技术的发展，研究人员能够前所未有地深入到单个细胞层面，解析复杂的组织结构和细胞间的动态关系。2024年6月21日发表在《科学进展》上的一项研究通过整合多种单细胞转录组数据，绘制了心脏纤维化的全景图谱，为未来的抗纤维化治疗策略提供了新的研究方向。

二、研究背景
心血管疾病是全球范围内的主要死亡和致残原因，而心脏纤维化是大多数心血管疾病中的关键病理特征。心脏纤维化主要由活化的心脏成纤维细胞和收缩型肌纤维细胞（MYOs）引发，它们会导致异常的细胞外基质积累，从而损害心脏功能。虽然心脏纤维化在最初阶段可能具有保护作用，但长期来看会引发不可逆的心脏损伤。心脏纤维化是许多心血管疾病如高血压、心肌梗死和心力衰竭等的共同病理特征。传统研究通常基于组织切片或散装样品，难以区分出具体细胞亚群的贡献。然而，心脏组织的异质性使得研究纤维化进展的细胞基础变得至关重要。近年来，单细胞RNA测序技术（scRNA-seq）为科学家提供了一个强大的工具，可以在单细胞分辨率下研究细胞群体的异质性和复杂性。这项研究的背景正是基于这种技术发展，试图揭示心脏纤维化过程中的细胞多样性。

三、研究方法
研究团队采集了小鼠和人类的心脏组织样本，覆盖了从健康状态到不同病理条件下的广泛谱系。通过单细胞RNA测序，研究者们分析了在心肌梗死后的不同时期和非缺血性损伤中的成纤维细胞群体。这些数据被整合到一个统一的图谱中，展现了成纤维细胞在不同时间点和病理条件下的分布和状态变化。
具体来说，研究包括了：
1样本收集：来自小鼠和人类的心脏组织，包括健康对照和病变组织。
2单细胞RNA测序：利用scRNA-seq技术进行测序，得到高分辨率的基因表达数据。
3数据分析：通过聚类分析和基因表达模式识别，研究者们定义了多个成纤维细胞亚群，并通过时间序列分析描绘了这些亚群在纤维化进程中的动态变化。
4跨物种比较：通过比较小鼠和人类的成纤维细胞数据，研究揭示了物种间的保守性和差异性，为模型生物的研究提供了新的见解。

四、下面就是文章结果部分的详细展示了：

Figure1:在健康心脏和心肌梗塞（MI）心脏中识别的主要心脏成纤维细胞（CF）亚群

在健康和心肌梗塞（MI）心脏中，研究识别出多种主要的心脏成纤维细胞（CF）亚群。健康心脏中存在的主要亚群包括F-SH和F-SL，其中F-SH富含干细胞标记，可能代表未成熟的储备细胞，用于在稳态和受损后增殖生成特化CFs，而F-SL则可能由F-SH通过动态平衡产生。F-WntX和F-Trans是与WNT通路和过渡性基因表达相关的亚群，前者可能起源于心外膜，后者位于F-SL和F-WntX之间。IR亚群主要在MI心脏中出现，尤其是在MI后的第一天，表现为强烈的抗氧化和前炎症基因表达。F-Act在健康心脏中存在，MI后数量增加，标志着细胞外基质和组织发育基因的增强表达。F-CI和F-Cyc是与细胞周期相关的亚群，主要在MI后的第三天出现。MYO和MFC则在MI后的第5至7天出现，参与疤痕重塑，MYO表现出纤维化基因的显著上调，而MFC则参与疤痕的长期存在和重塑。最后，F-IFNS亚群表现出强烈的干扰素响应特征，稀有但在整个MI过程中持续存在，具有潜在的前炎症功能。

以下是给各位观众老爷准备的marker gene和细胞的相关特征：

Figure2: 心肌梗死早期心脏纤维细胞分化轨迹分析及关键调控因子的解析

这项研究通过轨迹分析和差异基因表达分析，揭示了心脏纤维化在不同心肌梗死（MI）时间点的细胞分化和转变过程。研究表明，不同阶段的成纤维细胞（CFs）在健康心脏和MI早期（第1至5天）及晚期（第7至14天）表现出非线性的分化轨迹，尤其是F-CI在早期的关键作用以及MYO通过多种路径形成的机制（图2A）。此外，差异基因表达分析进一步揭示了IR在调控细胞凋亡中的独特性，以及F-CI和F-Cyc在蛋白质生物合成中的重要性（图2B-C）。时间动态分析显示，与IR相关的细胞凋亡调控在MI第1天达到峰值，而与F-Act和F-CI相关的基质组织模块在MI第7天逐渐达到高峰（图2D）。最后，研究还通过TF网络分析揭示了不同CF状态的调控机制，并确定了IR、F-CI和F-Cyc在早期MI中与细胞增殖和癌症相关的独特TF网络（图S5和S6）。 通过对IR细胞的再聚类分析，研究揭示了IR细胞在MI第1天主要聚集在一个独立群体中，而在MI第3天和第5天，它们逐渐转变为F-CI、F-Cyc和MYO等状态。E部分的UMAP图显示，这些转变群体是明确分离的（图2E）。F部分表明，在MI第3天大多数IR细胞已经转变为F-CI，而MYO细胞则在MI第5天显著增加（图2F）。G部分通过基因表达分析展示了IR细胞标志物的表达动态，显示IR细胞在MI第1天富集早期标志物如Mt2和Angptl4，而这些标志物在MI第3天和第5天逐渐下调，同时ECM和MYO相关标志物如Cthrc1和Fn1则在MI第3天和第5天显著上调（图2G）。这些结果表明IR细胞在MI第1天后快速转变为其他纤维细胞状态，进一步支持了MYO主要在MI第5天之后积累的结论。

Figure3:心肌梗死后成肌纤维细胞和心肌纤维细胞中促纤维化与抗纤维化亚型的动态变化及其分子特征

在心肌梗死（MI）后的恢复过程中，成肌纤维细胞（MYO）可分为促纤维化（MYO-2）和抗纤维化（MYO-1）两种亚型。通过整合分析发现，这两种亚型不仅在成肌纤维细胞（MYO）中存在，还出现在心肌纤维细胞（MFC）中。UMAP图（图3A和3B）显示，促纤维化的MYO-2标志基因在MYO和MFC中交界区域表达，而抗纤维化的MYO-1标志基因在MFC中表达更高。进一步的机器学习分析表明，这些亚型的比例随着时间推移而变化（图3C）。此外，转录因子分析揭示，MYO-2中VDR、GLI2和SMAD3通路活性较高，而MYO-1则以雌激素受体（ESR1）和SMAD1/5通路为主导（图3E）。这些发现表明MYO和MFC中的不同亚型可能对心肌纤维化的进程产生不同影响。

Figure4交叉疾病CF数据集的整合

研究通过整合心肌梗死（MI）、缺血再灌注损伤（IRI）、血管紧张素II（AngII）诱导的高血压和主动脉缩窄（TAC）模型的心脏成纤维细胞（CF）单细胞RNA测序数据，探讨了在不同疾病背景下成肌纤维细胞（MYO）和心肌纤维细胞（MFC）亚型的存在与动态变化。使用cFIT工具整合不同实验数据，并通过随机森林分类器（RF）预测各细胞类型。结果表明，IRI模型中的细胞与MI早期阶段高度相似（图4C、4D），MYO细胞占主导地位；而在AngII和TAC模型的后期阶段，MYO细胞的比例显著减少（图4C、4D），而MFC和F-Act细胞的比例有所增加（图4C、4D、4E、4F）。此外，Thbs4和Cilp在不同CF亚型中的表达模式也进一步表明这些标记基因在压力超负荷条件下特定亚型的诱导作用（图4F、S8A、S8B、S8C）。

Figure5 AngII模型中成纤维细胞（MFC）与肌成纤维细胞（MYO）的动态变化及其起源探讨

在AngII模型中，成纤维细胞（MFC）在缺乏肌成纤维细胞（MYO）的情况下大量存在，这提出了MYO是否在早期生成或MFC是否具有不同的细胞轨迹的问题。虽然胶原沉积在压力负荷引起的心脏肥大中已被确立，但利用α-SMA等标记物证明MYO形成的证据并不充分。有研究表明，心脏成纤维细胞的激活和胶原沉积可以在没有MYO分化的情况下发生。通过基因谱系追踪，研究发现AngII心脏在第7天（图5A）出现瞬态的肌成纤维细胞生成，随着时间的推移，这种现象在第14天（图5B到D）得到解决。在第7天，免疫荧光染色显示大量的tdTomato+α-SMA+成纤维细胞与胶原沉积相关（图5E和图S9），而在第14天，这些细胞是α-SMA低或阴性，与MFC的身份一致。研究假设，尽管施加了持续的血管紧张素刺激，MYO的存在仍被MFC取代，表明MYO在体内是自我限制的。

Figure6  AngII诱导的心脏纤维化过程中MYO和MFC的动态变化及其与胶原沉积的关联

在AngII模型中，心脏纤维化过程中成纤维细胞（CF）的动态变化被研究。图6A显示了研究设计的概要，表明在AngII诱导的早期阶段，第7天时，免疫荧光染色检测到有tdTomato+α-SMA+的肌成纤维细胞（MYO）短暂生成。这些细胞与胶原沉积相关，但在第14天时，这些细胞减少或消失，显示为α-SMA低或阴性，与图6B-D中显示的MFC身份一致。图6E展示了第7天时，AngII处理的心脏切片中大量的tdTomato+α-SMA+细胞，这些细胞与显著的胶原沉积区域相关联（用绿色标记显示），表明MYO在此时有短暂的活跃。图6F显示第14天时，MFC开始主导，这些细胞表现出α-SMA低或阴性的特征，并且胶原沉积仍在进行。

Figure7  AngII诱导的心脏纤维化过程中MFC在缺乏显著MYO的情况下替代MYO的动态过程

在AngII模型中，随着时间的推移，MFC替代MYO的动态变化过程。在第7天至第14天期间，MFC逐渐成为主导细胞类型。图7A展示了MFC在AngII处理的第7天和第14天之间逐渐取代MYO的过程。图中标示出，尽管MYO的初始生成是短暂的，MFC在第14天时成为主要细胞类型。图7B-C通过免疫荧光染色分析了第7天和第14天时的细胞标记，显示出tdTomato+α-SMA+细胞在第7天时数量较多，而在第14天时显著减少，MFC的标记物（如α-SMA低或阴性）在第14天时呈现出显著特征。图7D展示了在整个过程中，胶原沉积的逐渐增加，并与MFC的出现相关联，表明在AngII诱导的纤维化模型中，MFC可能在没有MYO的显著参与下主导了纤维化的进程。

Figure8：心脏纤维化过程中MFC和MYO在不同病理模型中的对比分析

对比在不同心脏病理模型中，MFC和MYO的动态变化及其在纤维化过程中的作用，进一步验证了这些细胞类型在不同心脏疾病背景下的表现。图8A展示了在AngII模型、TAC（主动脉缩窄）模型以及IRI（缺血再灌注损伤）模型中，不同时间点MFC和MYO的比例变化。结果表明，在AngII和TAC模型中，MFC是主要的纤维化细胞，而MYO的存在较少；相反，在IRI模型中，MYO在纤维化早期占主导地位。图8B通过免疫荧光和qPCR分析，进一步验证了这些模型中MFC和MYO的标记物表达差异。数据表明，尽管MYO在IRI模型中表现出显著的α-SMA和其他成肌标记物表达，但在AngII和TAC模型中，MFC的标记物，如抗胶原蛋白和抗纤维连接蛋白，表现更为显著。图8C总结了不同模型中纤维化的程度和细胞类型的动态变化，表明在压力负荷和心脏损伤诱导的纤维化中，MFC逐渐取代MYO，成为主要的纤维化驱动细胞。

Figure9 MFC和MYO在不同纤维化阶段的基因表达谱分析

分析了MFC和MYO在心脏纤维化过程中不同阶段的基因表达谱，揭示了这些细胞类型在纤维化进程中的功能差异。图9A展示了在不同时间点（如第7天和第14天），MFC和MYO的主要基因表达差异。通过RNA测序分析，发现MFC在纤维化晚期（第14天）表现出更强的抗纤维化基因表达，而MYO在早期阶段（第7天）则表现出显著的成肌基因表达。图9B通过热图展示了在MFC和MYO中差异表达的基因，包括那些与胶原合成、细胞外基质（ECM）重塑、细胞增殖和抗纤维化相关的基因。结果表明，MFC在纤维化晚期的基因表达更倾向于促进组织重塑和减少纤维化，而MYO则在纤维化早期通过增强胶原合成和ECM积累推动纤维化。图9C展示了通过qPCR验证的部分关键基因，包括MYO中特异性上调的成肌基因和MFC中特异性上调的抗纤维化基因。这些基因的表达模式进一步支持了MFC在纤维化晚期的功能性转变。图9D总结了MFC和MYO在不同时间点的基因表达变化，并提出了MFC在纤维化进程中的关键调节作用，特别是在减少晚期纤维化和促进组织修复方面的贡献。

五、本文的亮点和创新点如下：
1单细胞转录组整合分析：本文利用单细胞RNA测序技术，构建了一个全面的心脏纤维化转录组整合图谱。这一整合分析跨越了多个病理模型，包括缺血性和压力负荷性心肌病，揭示了心脏成纤维细胞（CF）在不同病理状态下的多样性和动态变化。这种高维度数据整合提供了前所未有的细胞层面洞察，有助于深入理解纤维化的病理生理机制。
2细胞谱系追踪与基因表达关联：通过基因谱系追踪和免疫荧光染色，本研究首次系统地揭示了在AngII诱导的心脏纤维化过程中，肌成纤维细胞（MYO）的短暂存在和基质纤维细胞（MFC）的长期主导作用。研究显示，尽管MYO在早期阶段生成，MFC最终在纤维化进程中取代MYO，表明MYO的自我限制性和MFC在长期纤维化中的关键角色。
3不同病理模型中的细胞动态对比：本文创新性地比较了不同心脏病理模型（如AngII、TAC和IRI）中MFC和MYO的动态变化。研究发现，在压力负荷（如AngII和TAC）诱导的模型中，MFC在没有显著MYO参与的情况下主导了纤维化过程，这与缺血再灌注模型（IRI）中MYO的主导地位形成鲜明对比。
4基因表达谱的时间动态分析：研究通过多时间点的基因表达分析，展示了MFC和MYO在纤维化过程中不同阶段的功能差异。特别地，MFC在纤维化晚期展现出抗纤维化的基因表达谱，而MYO在纤维化早期促进了胶原合成和细胞外基质的积累。这一发现为理解纤维化的动态调控机制提供了新的视角。
5心脏纤维化中的新型调控机制：通过对转录因子网络的深入分析，本文揭示了调控MFC和MYO状态转换的关键转录因子，并指出了不同病理状态下这些转录因子的差异性表达和功能。这些发现为未来针对纤维化的基于基因和分子靶标的治疗策略提供了理论基础。
注：
1.AngII模型（血管紧张素II诱导模型）：原理：AngII模型通过给实验动物（通常是小鼠或大鼠）注射或植入释放血管紧张素II（Angiotensin II, AngII）的泵，诱导高血压和心脏重构。AngII是一种强效的血管收缩剂，能够引起血压升高、血管硬化和心肌纤维化。用途：该模型主要用于研究高血压相关的心脏疾病，尤其是心脏纤维化的病理过程。通过观察在AngII刺激下心脏成纤维细胞的行为，可以了解压力负荷对心脏的长期影响。
2.TAC模型（主动脉缩窄模型）：原理：TAC模型（Transverse Aortic Constriction）通过在小鼠或大鼠的主动脉上施加部分阻塞，增加左心室的压力负荷。这样做模拟了临床上由于主动脉瓣狭窄或高血压导致的心脏压力过载。用途：该模型用于研究压力负荷引起的心肌肥厚和心脏重构，尤其是压力过载导致的心肌肥大和心脏纤维化。TAC模型广泛应用于研究压力负荷型心肌病和心力衰竭的病理生理机制。
3.IRI模型（缺血再灌注损伤模型）：原理：IRI模型（Ischemia-Reperfusion Injury）通过暂时性阻断心脏的冠状动脉血流（通常是通过结扎冠状动脉），然后恢复血流，模拟心肌梗死和随后的再灌注过程。这一过程导致心肌细胞的损伤和死亡，以及随后的炎症反应和纤维化。用途：该模型主要用于研究急性心肌梗死后心脏组织的损伤修复过程，尤其是再灌注后引起的心肌纤维化和炎症反应。它帮助科学家们理解缺血性心脏病的急性和慢性后果，并为开发新的治疗策略提供了实验基础。

写在最后：为啥喜欢苏轼，说实话我也不好去解释为啥，说喜欢他的才情，豁达，抑或是丰富的生活经历，确实都是（哈哈哈，小虚伪一下），好了好了，不扯了，这篇文章作者团队是有提供原代码的，感兴趣的观众老爷可以从以下链接自取哟
https://github.com/VCCRI/FibroblastIntegration
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