文献分享｜Nature Communications｜单细胞Total RNA-seq分析揭示转录调控中心

文献分享｜Nature Communications｜单细胞Total RNA-seq分析揭示转录调控中心 by 杨朝勇课题组

大家好！为大家介绍一篇2024年发表在Nature Communications的文章，题目为“Single-cell total-RNA profiling unveils regulatory hubs of transcription factors”。本文中，作者开发了一种基于多重退火循环扩增引物的单细胞Total RNA测序方法，具有同时检测单细胞中前体RNA与剪接后RNA的能力。本文的通讯作者是美国贝勒医学院的Chenghang Zong。Chenghang Zong的研究方向集中于单细胞分析方法，包括单细胞算法开发、单细胞技术在肿瘤发生与衰老中的应用研究等。

背景介绍

RNA Velocity（RNA速率分析）是一种能够重塑RNA转录、剪接与降解过程的动力学分析方法，通过比较未剪接的前体mRNA和剪接后成熟mRNA的相对含量，来分析mRNA的剪接和降解速率。根据剪接前后mRNA丰度的动态变化，可以预测单细胞转录状态的变化趋势和细胞命运。目前常用的转录组分析方法是基于Oligo-dT引物捕获Poly(A)尾的mRNA，主要检测和分析的是剪接之后的RNA，而忽略了细胞中未剪接RNA的信息。因此，同时分析单细胞中剪接与未剪接的RNA能够更精准地重塑单细胞中的RNA动力学过程。

设计思路

本文开发了SnapTotal-seq方法，可以进行单细胞的全转录组测序。如图1a，SnapTotal-seq使用了多重退火循环扩增的引物，在低温下可实现引物与单细胞中RNA的随机结合，逆转录后引物序列离开RNA，实现模板转换，并进行后续的文库构建，使用了Cell Barcodes与UMI来进行细胞和分子的区分与计数。在1 M reads的深度下，SnapTotal-seq基于外显子与内含子的reads都能够检测到一万多种基因，说明此方法可高效捕获到剪接与未剪接的RNA（如图1b）。本文使用RNA Velocity分析重构基因表达过程。如图1c-e，以293T细胞作为模型，基于SnapTotal-seq的数据能够精确刻画G2/M→G1→S→G2/M这一细胞周期的动态转换。与其他的单细胞测序方法相比，同样为单细胞Total RNA测序的VASA-seq也可重构相对精确的细胞周期动态转化，而基于Oligo-dT引物捕获Poly(A)尾RNA的CEL-seq2与Smart-seq3，其RNA Velocity分析结果则明显不如Total RNA测序的分析方法（图1f-1p）。

图1. SnapTotal-seq方法及其效果验证

数据介绍

确定细胞周期进程中的差异表达基因

作者根据细胞周期轨迹的基因表达变化，将不同细胞状态间的差异基因分成了三种类型（图2a）：Type Ⅰ是外显子与内含子reads丰度都有显著性变化的基因，即RNA剪接前后都存在显著性变化的基因；Type Ⅱ是只有剪接RNA存在显著变化的基因；Type Ⅲ是仅未剪接RNA有显著性变化的基因。其中Type Ⅰ发生的变化可能是由DNA转录为RNA的转录过程调节的；而Type Ⅱ与Type Ⅲ的变化可能是由转录之后的RNA剪接或修饰过程调节的。

如图2b-d，本文基于Type Ⅰ基因在各状态的细胞中的表达丰度变化，将基因分成了五种表达模式，并发现剪接与未剪接RNA的相关性较强，可能是由于剪接过程的存在，两者的变化存在微小的延迟。为了验证本文根据细胞周期筛选出的差异表达基因的准确性，作者收集了G1、S/G2、G2/M时期的细胞，随机选择8个Type Ⅰ基因并利用qRT-PCR检测它们的基因表达水平，结果这些基因的差异表达在剪接与未剪接RNA中都显示与细胞周期有关（如图2e-g）。有超过50%的Type Ⅰ基因是尚未被报道的细胞周期相关基因，这些新发现的基因主要富集在细胞中有机氮化合物的合成、碳水化合物衍生物的代谢等细胞功能通路中（图2h-n）。

图2. Type Ⅰ基因的功能性分析

鉴定细胞周期进程中的关键转录因子

Type Ⅰ的基因随着细胞周期表达的变化很可能是由于DNA到RNA的转录过程影响的，而调控转录过程的一个重要因素是转录因子（Transcriptional Factor, TF）——一种通过与DNA相互作用在转录水平参与基因表达调控的蛋白质。如图3a-d，为了筛选出调节细胞周期进程的关键TF，本文利用回归算法研究TF的剪接后RNA表达水平与靶基因未剪接RNA转录水平的相关性，检测出Type I中的23个TF的潜在下游的靶基因，根据靶基因的转录活性分成4个Hub。

为了鉴定23个TF之间的互相调控作用，本文使用LASSO 回归分析了每个TF的转录活性是否会被其他TF调控，构建了TF调控网络（图3e）。其中Hub 3中的TF大多是网络的中心节点，与其他Hub的TF具有上下游调控关系，暗示了Hub 3的TF可能在细胞由G1/S到G2/M的转化中起着关键作用。

接着，本文在参考了ChIP-seq的数据后富集了6个TF（图3f），并对这6个TF的相互调节关系进行更为详细的分析。如图3l，本文观察到一个正反馈回路以保证G1/S期的基因表达稳定。G1/S期的TFs正向调节MYBL2的表达，上调的MYBL2随后激活FOXM1的表达，促使细胞由G1/S期过渡至G2/M期。这一结果表明了MYBL2在推动细胞状态从G1/S向G2/M转变中起着关键作用。

图3. 重构细胞周期的转录因子调控网络

鉴定细胞周期进程中的关键RNA结合蛋白

Type Ⅱ的基因是仅剪接RNA丰度存在显著性差异，暗示这类基因的表达主要受到转录后调节的调控。基于Type Ⅱ的基因的表达活性变化，本文将其分为5种动力学表达模式（图4a-c），并对每种模式进行了GO富集分析（图4d-f）。

RNA结合蛋白（RNA binding proteins, RBPs）是一种已知的调节RNA转录后进程的蛋白质，作者探索了RBPs对Type Ⅱ基因表达差异的调控作用。发现在Type Ⅱ的基因中有8种RBPs的结合靶点（图4g）。进一步评估RBPs与靶基因的表达关系后发现，对于能够增强RNA稳定性的BCLAF1与G3BP1，它们的靶基因表达与其本身表达呈正相关；对于促进RNA降解的PUM1，它们的靶基因的表达则与其表达呈负相关（图4h）。由于PUM1与G3BP1的表达均需要维持动态的平衡来实现细胞周期的推进，在这两个基因敲除后，可观察到细胞的存活率明显降低（图4i）。

图4. Type Ⅱ基因的转录后调节

确定OIS进程中的差异表达基因与转录因子调控网络

接下来，作者将SnapTotal-seq应用于对肿瘤基因诱导的细胞衰老死亡过程（Oncogene-Induced Senescence, OIS）的研究中（图5a）。通过诱导胰腺癌Oncogene KRASG12D的表达，并收集0、1、2、3、5天的人胰腺导管细胞进行SnapTotal-seq分析。由细胞的分群结果可知，在KRASG12D基因表达之后细胞逐渐进入G0期（图5b-d）。与前文的思路类似，作者依照剪接与未剪接RNA丰度变化将差异基因分成三种类型，并详细研究其中Type Ⅰ基因的表达丰度变化（图5e-g），选出了112个可能的TF，并根据TF的活性分为3个Hub。其中Hub2与其他Hub具有更多的上下游调控关系，说明Hub2在细胞的状态转变中可能起到比较关键的作用（图5h-j）。

图5. OIS进程中的动态转录

鉴定OIS进程中的关键转录因子

为了得到更有说服力的结果，文章参考了ChIP-seq数据库，发现112个TF中有25个TF的下游靶基因也在ChIP-seq中被显著富集（图6a）。其中，随着细胞进入G0期，Hub3的靶基因表达越来越活跃，根据靶基因表达表达的活跃程度，Hub3的TF进一步被分为两个亚类，两个亚类的靶基因分别作用于免疫反应和应激反应的调节，说明了不同TF在肿瘤基因诱导的衰老死亡中具有独特的功能。通过TF调控网络的构建：发现Hub3.1调控网络与Hub2中的TF有关；而Hub3.2的调控网络中，ATF4是上游TF，级联的调控网络说明了ATF4在细胞的应激反应通路中具有核心作用（图6b-e）。

图6. OIS进程中的TF调控网络

总结

本文开发了一种单细胞Total RNA测序方法：SnapTotal-seq。该技术可以提升RNA速率的分析效果，较为精确地重构细胞周期的动态变化。通过构建转录因子调控网络，确定了介导细胞周期动态的关键转录因子调节中心。最后，本文将此方法应用于分析癌基因诱导的细胞衰老，并确定了控制细胞进入衰老的关键转录因子。

原文链接

https://www.nature.com/articles/s41467-024-50291-3

撰稿人：林诗妍

校稿/推送：µ

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