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2 years ago 生信实操丨只需学会这几招，让你的单细胞测序分析图向CNS看齐！ by i生信
单细胞转录组学测序是目前比较火热的组学技术，单细胞测序在很多高分文章中露脸的次数非常频繁。然而数据拿到手，分析后的可视化也是发文章时的重点内容。看到CNS或者其他高质量文章中单细胞的可视化总是一种高大上的感觉，可是自己手里的数据可视化却是与别人有很大差距。那么，接下来就随着笔者初探单细胞作图的修饰，抛弃默认出图，修饰作图，提高档次，向好的文章看齐！也让自己的数据有一个更好的呈现！
为了方便演示，示例数据我们采用Seurat官方提供的PBMC单细胞数据。首先加载数据。
1.library(SeuratData) #加载seurat数据集2.InstallData("pbmc3k")3.data("pbmc3k")PBMC <- pbmc3k.final
可能到这里会发现一个错误。
1.#ERROR2.#Error in eval(call("@", object, slot)):3.#"images"槽名不存在于"Seurat"类别对象中
这是因为加载的数据时Seurat较早的版本，目前已经更新到4.0了，所以需要将其转换一下。（知识点：例如在公共数据库挖掘时，拿到别人Seurat2的数据时，就可以用下面的函数转化）
PBMC = UpdateSeuratObject(object = PBMC)#旧版的seurat对象转变为新版数据准备完成了，就开始真正的操作吧！
所有的画图软件都会有一个默认的配色，单细胞作图的seurat也不例外。但是如果你阅读了足够多的单细胞好文章，就会发现，这些文章基本无一例外的，都不会使用默认的配色，而是选择自己配色，让图形可视化更加好看。
一般默认情况下，seurat做出的UMAP图如下，这种配色其实很普通，如果整个文章都是这个色调，看起来不是很好。
1.#普通展示细胞聚类图DimPlot(PBMC, label = T)+NoLegend()
如果稍加修饰，修改坐标轴，去除坐标轴刻度，自定义添加标题，给UMAP图加上边框等等修饰，立马就能看出区别。但是相比于高分文章，还是有点欠缺。
1.DimPlot(PBMC, label = T)+2. NoLegend()+labs(x = "UMAP1", y = "UMAP2") +3. theme(axis.text.y = element_blank(),4. axis.ticks.y = element_blank(),5. axis.text.x = element_blank(),6. axis.ticks.x = element_blank())+7. theme(panel.border = element_rect(fill=NA,color="black", size=1, linetype="solid")) #加边框
其实关键的还是对颜色的修饰，以两篇高分文章的配色为例看看效果：
#第一种配色方案来源于《Cell》文章：DOI：10.1016/j.cell.2021.05.013。
1.library(paletteer) #提供了 R 编程环境中提供的数百种其他调色板的组合集合，详情可以查看此包，总有你满意的方案2.pal <- paletteer_d("ggsci::nrc_npg")[c(1,3,4,9,5,2,6,8,10)] #有几群细胞需要标记就选几种颜色3.DimPlot(PBMC, label = T,4. cols= pal, #设置颜色5. pt.size = 1.5,#设置点的大小6. repel = T)+#标注有点挤，repel=T可以让排列更加合理NoLegend()
是不是感觉有那“味”了！
#第二种配色方案来源于《Nature communications》发表的文章：https://www.nature.com/articles/s41467-021-25246-7#Sec24
1.library(RColorBrewer)#配置自己需要的颜色2.cell_type_cols <- c(brewer.pal(9, "Set1"), "#FF34B3","#BC8F8F","#20B2AA","#00F5FF","#FFA500","#ADFF2F","#FF6A6A","#7FFFD4", "#AB82FF","#90EE90","#00CD00","#008B8B","#6495ED","#FFC1C1","#CD5C5C","#8B008B","#FF3030", "#7CFC00","#000000","#708090")3.DimPlot(PBMC, label = T,4. cols= cell_type_cols, #设置颜色5. pt.size = 1.5,#设置点的大小6. repel = T)+#标注有点挤，repel=T可以让排列更加合理7. NoLegend()
这样做出的图更加好看，符合高分文章的标准！
UMAP图还有一个重要的作用是是展示某些基因在cluster中的表达。
1.#默认作图2.FeaturePlot(PBMC, features = "S100A8")3.#修饰图片4.mycolor <- c('lightgrey', 'blue','seagreen2')#设置颜色5.FeaturePlot(PBMC, features = 'S100A8',cols = mycolor, pt.size = 1.5)+theme(panel.border = element_rect(fill=NA,color="black", size=1, linetype="solid"))#加边框
热图是单细胞测序数据分析中展示marker基因的重要方式，一般使用DoHeatmap函数实现。默认的图片也是可以的，但是缺乏生动的感觉，所以很少文章用默认的画图，多多少少也是进行了修饰。
这里用每个cluster前top3基因演示，默认的绘图如下：
1.DoHeatmap(PBMC,2. features = as.character(unique(top3$gene)),3. group.by = "seurat_clusters",4. assay = "RNA")
我们对热图配色进行修改，看起来会顺眼很多！
1.DoHeatmap(PBMC,2. features = as.character(unique(top3$gene)),3. group.by = "seurat_clusters",4. assay = "RNA",5. group.colors = c("#C77CFF","#7CAE00","#00BFC4","#F8766D","#AB82FF","#90EE90","#00CD00","#008B8B","#FFA500"))+ #设置组别颜色6. scale_fill_gradientn(ccolors = c("navy","white","firebrick3"))#设置热图颜色
看这个热图，其实我们可以发现，4群和6群的细胞marker基因表达一致，但是热图是按照0-8这个顺序排列的，如果将顺序调整一下，自定义cluster的排序，会让结果看起来会更加明显。
1.PBMC$seurat_clusters <- factor(x = PBMC$seurat_clusters, levels = c('0','1','2','3','4','6','5','7','8'))2.DoHeatmap(PBMC,3. features = as.character(unique(top3$gene)),4. group.by = "seurat_clusters",5. assay = "RNA",6. group.colors = c("#C77CFF","#7CAE00","#00BFC4","#F8766D"，"#AB82FF","#90EE90","#00CD00","#008B8B","#FFA500"))+ #设置组别颜色7. scale_fill_gradientn(ccolors = c("navy","white","firebrick3"))#设置热图颜色
当然了，以上的改变我们都是在Seurat默认画图函数的基础上修饰得到的，如果要通过marker基因从头画热图，则需要提取表达矩阵和分组信息，用Heatmap来做。具体已经有人做了这个工作，可以参考链接：
https://www.it610.com/article/1211113345411813376.html
小提琴图也是文章中最常见的图，例如下图，也是比较好看的，可以用于展示marker基因。
（文章截图）【1】
但是R语言画出来的小提琴图只能单独展示一个基因的表达，笔者在查阅后发现，文章中这种小提琴图基本是用Python画的，这就很不友好，总不能为了一个图学python吧，也太费时间了。不过还好，有人已经通过改造，出了一个包，帮我们解决这个问题（感谢分享者）。
1.install.packages("remotes")2.remotes::install_github("lyc-1995/MySeuratWrappers")#通过链接安装包3.library(MySeuratWrappers)4.#需要展示的基因5.markers <- c('CD3D', 'S100A8', 'S100A9', 'CD79A', 'CCL5', 'NKG7', 'GZMA', 'IL32', 'CD4', 'CD8A', 'LTB', 'FCN1', 'MS4A1', 'SPON2','FCER1A','SERPINF1', 'TMEM40', 'CD3E')6.my36colors <-c('#E5D2DD', '#53A85F', '#F1BB72', '#F3B1A0', '#D6E7A3', '#57C3F3', '#476D87', '#E95C59', '#E59CC4', '#AB3282', '#23452F', '#BD956A', '#8C549C', '#585658', '#9FA3A8', '#E0D4CA', '#5F3D69', '#C5DEBA', '#58A4C3', '#E4C755', '#F7F398', '#AA9A59', '#E63863', '#E39A35', '#C1E6F3', '#6778AE', '#91D0BE', '#B53E2B', '#712820', '#DCC1DD', '#CCE0F5', '#CCC9E6', '#625D9E', '#68A180', '#3A6963', '#968175')#颜色设置7.VlnPlot(PBMC, features = markers,8. stacked=T,pt.size=0,9. cols = my36colors,#颜色10. direction = "horizontal", #水平作图11. x.lab = '', y.lab = '')+#横纵轴不标记任何东西12. theme(axis.text.x = element_blank(),13. axis.ticks.x = element_blank())#不显示坐标刻度
最后利用AI将图片稍加修饰，就可以得到与别人文章中一样的图了。
DotPlot函数可以展示感兴趣基因的表达量，也是发文章比较喜欢用的图，默认的图形如下：
虽然看起来也可以，但是看起来没有很惊艳，如果对于颜色和外形做点修饰，会更加吸引眼球，为自己文章增色不少！
1.#dotplot的改造2.DotPlot(PBMC, features = markers)+coord_flip()+theme_bw()+#去除背景，旋转图片3. theme(panel.grid = element_blank(),4. axis.text.x=element_text(angle=90,hjust = 1,vjust=0.5))+#文字90度呈现5. scale_color_gradientn(values = seq(0,1,0.2),ccolours = c('#330066','#336699','#66CC66','#FFCC33'))+#颜色渐变设置6. labs(x=NULL,y=NULL)+guides(size=guide_legend(order=3))
以上就是单细胞基础作图的一些修饰，只要用心，多看文章，向高分文章看齐，让自己的文章也更加显眼和惊艳！数据分析很重要，可视化也是非常重要的一部分，呈现效果好的话，对于自己的文章和数据都是锦上添花的作用。
参考文献：
【1】Wu, X., Liu, Y., Jin, S. et al. Single-cell sequencing of immune cells from anticitrullinated peptide antibody positive and negative rheumatoid arthritis. Nat Commun 12, 4977 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-25246-7
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