CRISPR-Cas9脱靶检测方法大全。

CRISPR-Cas9脱靶检测方法大全。 by 果子学生信

在前面我们简单聊了影响CRISPR-Cas9脱靶效应的因素（gRNA序列、靶序列活性），以及CRISPR-Cas9脱靶的特性（indels）。并指出脱靶不是CRISPR-Cas9专属的不良反应（ZFN、TALEN、RNAi等）。脱靶位置可能是由于靶序列的同源性或gRNA的特异性不够，还有就是Cas9作为核酸酶的通性（星号活性等）。

关于CRISPR-Cas9脱靶效应的检查，有两大阵营：计算机模拟计算方法以及基础研究实验方法 [1]。

1. 计算机模拟方法：

基于靶序列和其他序列的同源性，或者gRNA特异性不足造成的脱靶。结合实验数据或计算机算法，推测出潜在的脱靶序列。可以用过PCR产物桑格测序，查看是否有脱靶。这种我们称之为biased，而这种脱靶位点工具的运行机制又可分为两种：（1）基于序列比对的模型；（2）基于算法评分预测 [1]。

我一共用过两种：Off-Spotter以及CasOFFinder，对于同一个gRNA序列，在相同条件下Off-Spotter只找到1个预测的脱靶位点，而CasOFFinder则有6个之多，虽然测序结果都显示这些靶点都未被编辑，但CasOFFinder相交于Off-Spotter更为全面。感兴趣可点击前期文章：CRISPR/Cas9虽好，细节一大堆，来一起解决一下最常见的脱靶问题。

2. 基础实验方法（测序）：

2.1 全基因组测序（WGS）

全基因组测序（WGS）对Cas9引起的脱靶突变的评估偏差较小，目前都使用30-60x的测序深度。然而WGS价格昂贵，测序深度低则只有少数克隆被测序，可能会错过大多数低频脱靶事件。对于in vivo分析，WGS仍是首选的方法，而直接捕获DSB的技术，如GUIDE-Seq、BLESS，可能比WGS更强大。因为WGS也可以捕获细胞/动物模型之间自然发生的变化，这可能会使分析复杂化并产生误导。对于WGS分析，选择适当对照组尤为重要（设置不当可被撤稿）。要将WGS的假阳性和阴性率降至最低需要分析设置多个组别，既繁琐又昂贵。

2.2 Chip-Seq

Cas核酸酶也属于蛋白的一种，依照大家常规了解的生物信息学方法，可以使用相应抗体将Cas蛋白及其binding序列pulldown，然后送测序，这就是大家熟悉的Chip-Seq。而这种Chip-seq只用于dCas9 off-target检测，普通Cas9在切割靶标序列会后从DNA序列上掉落，因此其结合并不稳定。而dCas9是核酸酶活性缺失的蛋白，但在gRNA的引导下仍可与靶标序列结合，因此常用于CRISPRa（激活基因表达而非敲除）

DISCOVER-seq：也被称为MRE11 ChIP Seq，是近年新发展的CRISPR-Cas9 off-target测序方法。这种方法利用内源性DNA修复因子MRE12的招募来对Cas诱导的双链断裂进行全基因组鉴定。在DNA修复过程中，MRE12因子被会精准的招募到DSB发生位点，因此将MRE12结合位点pulldown并进行高通量测序，可同时查看on-target和off-target的情况，这种方法体内体外样本都适用。

2.3 Cas核酸酶切割位点、DSB位点富集测序

这种通过富集Cas核酸酶结合或者切割区域用于测序方法，我们称之为unbiased的检测方法。基于这种思路，人们设计的富集方法主要有：

（1）通过抗体pulldown：例如Chip-Seq；

（2）富集核酸酶切割位点：

Digenome-Seq全称 in vitro Cas9-digested whole-genome sequencing。Cas9切割后会留下一个5‘磷酸基团，可加接头用于PCR扩增，后可送NGS测序。因此在Digenome-Seq中，纯化的基因组DNA（gDNA）在体外用Cas9处理，连接adaptor后进行全基因组测序。这种方式适用于in vitro的样本。

CIRCLE-Seq的设计更为巧妙，首先将纯化后的gDNA剪切并环化，体外CRISPR/Cas9处理后，具有CRISPR/Cas9识别位点的环状DNA将被裂解，使DNA线性化，而线性化末端则可加上接头经PCR扩增后进行双端高通量测序。这种方式也适用于in vitro样本。

（3）富集DNA双键断裂区域（DSB），即DSB捕获：

在BLESS-Seq中，直接用链霉亲和素富集CRISPR-Cas9引导的DSB片段，外加adaptor即可用于测序。可链霉亲和素只能富集正在发生的DSB，对于已修复的则没有办法，因此被称为off-target快照，并不全面。这种方法常用于细胞和组织样本。

在IDLV-Seq，由于整合缺陷慢病毒载体（IDLV）可以通过NHEJ的方式结合的DSB中，因此可以IDLV序列作为PCR锚点扩增出DSB发生区域，以检测off-target。这种方法依赖于IDLV通过NEHJ方法修复到DSB中的效率，此外由于慢病毒的随机整合特性，还是有假阳性发生的可能。因此它的弊端为受效率限制及可能出现假阳性。

GUIDE-Seq与IDLV-Seq策略相似，将IDLV替换为更小的dsODN序列。做这个实验需要设置对照组，例如只转IDLV或dsODN来获取DSB背景噪音。由于GUIDE-Seq需要dsODN的共传递，所以不适合用于体内实验。

HTGST适用于检测CRISPR-Cas9导致的染色体导致（translocation），但CRISPR-Cas9的off-target还是以indels居多，这种情况较少。且这种方法仍受染色质可接触性的限制。

与富集核酸酶切割位点方法相比，DSB捕获方法在生理学上更相关，但可能效率较低，因为大多数DSB存在非常短暂，由于在体内的IDLV标记和原位连接子的连接都可能受到剪切位点附近的局部染色质和序列组成的影响，因此捕获可能存在偏差。

summary

测序方法太多，无法一一描述，下表是目前可以找到的最全面的总结。基于以上的描述，我们无法指出谁是最好的，只能依据具体实验需求和课题组经费条件，选择最合适的测序方法。不过依据个人的学习情况，我将自己较为喜欢的方法在下方表中打了个勾，仅为参考。

3. 尾声

随着CRISPR技术的使用更加普及，对于应用CRISPR文章的要求也会更高。大家使用CRISPR技术的时候，在实验设计上默认仅有目的基因发生改变，并没有设置更多的对照组，可能会成为后面的隐患。因此在早期用CRISPR技术进行基因编辑后要尽快进行off-target的检测，或者保留早期的样本（细胞和动物都会有自发的突变）。目前至少要做到biased的off-target检测，好让自己后续实验更为安心。阅读这篇文章课酌情搭配上篇讲CRISPR-Cas9脱靶特点的文章。今天就到这里了，期待下次再见。

参考文献：

Naeem, Muhammad et al. “Latest Developed Strategies to Minimize the Off-Target Effects in CRISPR-Cas-Mediated Genome Editing.” Cells vol. 9,7 1608. 2 Jul. 2020, doi:10.3390/cells9071608
Wu, Xuebing et al. “Target specificity of the CRISPR-Cas9 system.” Quantitative biology (Beijing, China) vol. 2,2 (2014): 59-70. doi:10.1007/s40484-014-0030-x
Ipek Tasan and Huimin Zhao. "Targeting Specificity of the CRISPR/Cas9 System." ACS Synthetic Biology 2017 6 (9), 1609-1613 doi: 10.1021/acssynbio.7b00270
Wienert, B., Wyman, S.K., Yeh, C.D. et al. CRISPR off-target detection with DISCOVER-seq. Nat Protoc 15, 1775–1799 (2020). doi.org/10.1038/s41596-020-0309-5

ixxmu / mp_duty