食管鳞癌肿瘤微环境中细胞的异质性

食管鳞癌肿瘤微环境中细胞的异质性 by 医学僧的科研日记

肿瘤微环境是一个由多种细胞组成的高度复杂的生态系统，对肿瘤生物学特性和治疗反应性具有重要影响。单细胞水平的转录组数据挖掘有助于深入剖析肿瘤微环境的异质性，并且该方法已在多种肿瘤中得到实践，公众号往期推文就有介绍过肾透明细胞癌和胃腺癌的相关研究，链接如下：

单细胞联合TCGA探究肿瘤异质性的奥秘(新套路)

单细胞水平揭示了原发性胃腺癌的转录异质性

今天再呈上一篇食管鳞癌肿瘤微环境的单细胞转录组分析，大家也可以前后对照一起阅读，看看有什么异同~

一、摘要

本文作者利用单细胞转录组对11例食管鳞癌（ESCC）微环境中的62161个细胞（来自外周血、肿瘤组织和癌旁正常组织）进行分析，发现食管鳞癌间质中的大多数细胞类型都有异质性，特别是成纤维细胞和免疫细胞。该研究中，作者确定了CST1+肌成纤维细胞的肿瘤特异性亚群，具有预后价值和潜在的生物学意义，并且CST1+肌成纤维细胞在其他类型的癌症中也具有高度的肿瘤特异性。此外，还发现并验证了具有抗原呈递作用的成纤维细胞亚群。同时，对髓系和T淋巴系的分析表明了ESCC微环境的免疫抑制特性，并确定了免疫检查点抑制剂在癌症中的特异性表达。

二、流程图

三、结果简述

1、食管鳞癌及癌旁正常组织的细胞微环境

经过单细胞捕获和测序质控，ESCC肿瘤样本中21355个细胞、癌旁正常食管组织中19882个细胞、外周血样本中20924个细胞被纳入。由于肿瘤组织和非肿瘤组织的基因表达在单细胞水平上有根本的不同，同时考虑到潜在的批次效应、样本变异，作者使用Seurat包整合转录组数据并进行降维和细胞类型聚类，根据明确的标记物确定主要细胞类型(如图B所示)。

作者鉴定了以下几种类型的细胞(图C)：上皮细胞(包括癌旁食管组织的上皮细胞和肿瘤细胞，称为“上皮/肿瘤”簇)、免疫细胞(髓样细胞、肥大细胞、T细胞和B细胞)、成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞。除了“上皮/肿瘤”簇主要由肿瘤样本组成，大多数细胞类型都是由肿瘤和非肿瘤样本组成的（图D）。

2、食管鳞癌中成纤维细胞的异质性

为了更好地了解食管鳞癌中成纤维细胞的多样性，基于测到的12126个成纤维细胞，作者进一步分析并将其分为7个亚群（图A）。

除F_3亚群在肿瘤中明显富集外，其余各亚群在肿瘤和非肿瘤标本中均有相当的丰度或主要富集于非肿瘤（图B）。注意鉴别：下方右图所示是指不同的肿瘤组织中，F_0亚群的占比普遍要高于F_3亚群，但并不能体现F_0亚群富集在肿瘤细胞中。

紧接着，作者通过亚群间的差异表达分析，确定了每个成纤维细胞亚群的差异表达基因（图C），值得注意的是不同的亚群表达不同的细胞外基质(ECM)蛋白谱(图D)，如MFAP5(F_0)、MMP1、MMP3、MMP10(F_1)、SRGN(F_2和F_5)、COL1A1、COL3A1、POSTN、MMP11(F_3)和SPP1(F_6)，除F_4外，每个成纤维细胞亚群至少表达一个特定的ECM基因。成纤维细胞最重要的功能之一是通过分泌重组ECM的分子来塑造组织结构。因此，这些结果提示不同的成纤维细胞亚群在ESCC中具有功能特异性。

3、肿瘤特异性CST1+肌成纤维细胞与ESCC预后不良有关

为了进一步了解成纤维细胞不同亚群的功能，作者根据每个亚群的差异表达基因进行了GO分析，其中最显著富集的是F_3亚群中的“胶原纤维组织”、“ECM组织”和“内胚层细胞分化”(图E)。事实上，与其他亚群相比，大多数ECM基因在F_3中的表达水平最高(图A)。

此外，多条证据表明F_3亚群代表激活的肌成纤维细胞：(1)编码α平滑肌蛋白（αSMA）的ACTA2在F_3中表达最强（图D）；（2）Hallmark通路分析表明F_3显著富集在增殖相关通路（Mitotic spindle）；(3)F_3也富集在蛋白分泌途径（Protein secretion）(图B)。已有研究表明，肌成纤维细胞通过不同途径促进癌症的发展和进展。

在TCGA等大队列ESCC样本的数据集中，肿瘤中的F_3特征基因表达明显强于非肿瘤样本（图A）。

作者通过F_3亚群中肿瘤与非肿瘤样本间的差异分析，将表达差异最显著的CST1作为F_3亚群的特定标志物（图B），并在批量表达数据中得到验证。在F_3与其他亚群的差异比较中，CST1也是表达差异最大的10个基因之一（图C）。

免疫荧光染色和免疫组化证实了CST1蛋白在肿瘤相关成纤维细胞间质中显著表达（图D-G）。

重要的是，CST1+肌成纤维细胞丰度与总生存期(P=0.0051，图H)和无病生存期(P=0.014，图3I)密切相关。此外，多变量COX回归分析证实CST1+肌成纤维细胞是食管癌患者的独立预后标记物(P=0.041)，CST1的表达与淋巴结转移(P=0.023)、浸润深度(P<0.001)和pTNM分期(P<0.001)显著相关。在另一组食管鳞癌患者中，使用批量表达数据验证了CST1表达的预后价值(P=0.039，图J)。这些数据共同证实了CST1+肌成纤维细胞在ESCC中的预后价值。

为了探索CST1+肌成纤维细胞在其他癌症类型中的存在，作者又分析了公开可获得的含有成纤维细胞的单细胞转录本，发现肺癌、结肠癌和头颈癌的成纤维细胞亚群中CST1的表达频率相当(1.22-3.61%，图k)。

4、食管鳞癌中的抗原提呈成纤维细胞

GO分析结果则提示F_2亚群主要富集在“抗原处理和提呈”和“干扰素信号通路”(图E)，F_2中所有最高差异表达的基因都属于MHCⅡ类（如HLA-DRA、CD74、HLA-DRB1、HLA-DPB1，图A）。这些基因通常在抗原提呈细胞(APC)中表达，如树突状细胞(DC)和巨噬细胞，因此，作者将这些F_2亚群细胞称为“抗原提呈成纤维细胞（ap-Fibro）”。与GO富集结果一致的是，Hallmark通路分析显示APC相关功能在ap-Fibro细胞中高度富集，如同种异体移植排斥反应和干扰素-γ反应。ap-Fibro还表达明确的成纤维细胞标志物(DCN、VIM、FSP1)，其表达水平与成纤维细胞的其他亚群相似，证实它们是具有成纤维细胞特性的细胞。

作者对16例食管癌患者的癌组织和配对的癌旁正常组织进行了Vim和HLA-DR双重染色，在VIM+细胞中一部分中表达HLA-DR(图B)。此外，免疫荧光染色法测定的HLA-DR+成纤维细胞比例(图C)与scRNA-Seq法测定的结果类似。

5、食管鳞癌的免疫细胞微环境

基于特征标记物对T细胞和髓系亚群进一步聚类分析，得到4个CD4+和2个CD8+T细胞亚群，8个单核/巨噬细胞亚群和6个树突状细胞(DC)亚群（图A-B）。

与胰腺导管腺癌、肺癌等癌症一样，Treg细胞在ESCC组织中聚集更多，为了探索其他CD4+T细胞亚群的生物学特性，作者确定了每个亚群的特征基因，特别注意的是，不同的CD4+T细胞亚群在食管癌组织中表达不同的免疫检查点因子。

来自肿瘤样本的CD8+T细胞亚群比非肿瘤样本表达更高的效应相关基因，包括趋化因子、细胞毒相关基因和促炎细胞因子。此外，两个亚群在肿瘤样本中免疫检查点的表达也高于非肿瘤样本。这些结果表明，食管癌微环境中的共抑制因子降低了CD8+T细胞的效应功能。

为了探索髓样细胞(DC、单核细胞、巨噬细胞)和T细胞亚群之间的相互作用，作者用CellPhoneDB方法对食管癌肿瘤和非肿瘤样本进行分析，发现肿瘤样本中髓系细胞和T细胞相互作用的总数明显高于非肿瘤样本(图5F)。此外，作者还发现，关键的免疫检查点抑制剂PD1-PDL1和CTLA4在肿瘤组织中的相互作用的得分高于正常组织(图5G)，这与肿瘤组织中CD4和CD8 T细胞耗竭的结论相一致。

6、食管鳞癌中髓系细胞的多样性和激活轨迹

传统的树突状细胞(CDC)分为cDC1和cDC2两个亚群，在ESCC的微环境中，树突状细胞（DC）具有显著的多样性，聚类得到五个cDC亚群(图6A)和一个表达LILRA4和IRF7的血浆细胞样亚群(pDC)。DC_1表达经典的cDC1特征基因，包括CLEC9A、XCR1、IRF8、BATF3，而DC_5则表达常规的cDC2标记，如FCER1A、CD1C。DC_3被检测到具有激活的DC标记(CD40、FSCN1、CCR7)，类似于在缺乏关键cDC1和cDC2基因表达的肺肿瘤中发现的一个亚群。DC_4表达髓系前体标志物，如转录因子Sox4(补充数据1D)，表明其具有不成熟特征。鉴于食管鳞癌中DC亚群的高度多样性，需要进一步研究其在食管鳞癌微环境中的作用。

此外，作者探究了单核细胞和巨噬细胞亚群表达的特征分子，结合已有的相关研究，表明不同的单核细胞亚群在食管癌微环境中具有免疫调节和促肿瘤作用，以及异质巨噬细胞群的免疫抑制功能。为了进一步分析ESCC患者免疫细胞的激活和分化轨迹，作者整合了来自三个ESCC患者的总共20924个PBMC细胞。发现髓系细胞在组织样本中更丰富，而B和T细胞在循环中更丰富；血液、非肿瘤和肿瘤样本之间髓系和T细胞亚群的明显分离，表明免疫细胞的组织相关调节（图F）。随后，作者进行扩散成分分析，以确定与观察到的细胞状态变化相关的基因表达模式。聚焦于髓腔，发现了三个主要的弥散成分（图G-H）。

第一成分反映了从血液单核细胞到组织单核细胞/巨噬细胞的轨迹，循环单核细胞基因（如FCN1，图I）呈负相关，而分化巨噬细胞中丰富的基因与第一扩散成分呈正相关。第二扩散成分的特征是激活的巨噬细胞基因（如APOE，图J），这可能反映了组织中单核细胞来源的巨噬细胞的激活。第三个扩散成分与DC细胞的标志物和已分化DC细胞中上调的基因(如CST7，图K)相关，表明在ESCC微环境中从pDCs到更成熟的DC亚群的轨迹。这些分析共同提出了在ESCC微环境中支持不同髓系细胞轨迹和分化的重要转录程序。

7、多重免疫荧光染色对候选细胞亚群的验证

作者进行了多重免疫荧光染色，以验证候选免疫抑制细胞(包括巨噬细胞和Tregs)、CD8+T细胞以及CST1+成纤维细胞之间的丰度和定位。结果表明与非肿瘤样本相比，肿瘤样本中CST1+成纤维细胞(图7C)、CD8+T细胞耗竭(图7D)、Treg细胞(图7E)以及M2样巨噬细胞(图7F)增加。此外，M2样巨噬细胞的丰度与肿瘤样本中耗竭的CD8+T细胞的丰度显著相关(图7G)，表明M2样巨噬细胞对CD8+T细胞的负调控。此外，肿瘤样本中观察到CST1+成纤维细胞和Treg细胞之间存在适度的正相关(图7H)。

四、总结

这项研究揭示了食管鳞癌的肿瘤微环境中大多数细胞类型的异质性，特别是免疫细胞(髓样细胞和T细胞)和成纤维细胞，并详细地剖析了各细胞亚群潜在的生物学作用和肿瘤进程中可能扮演的角色。此外，本研究把组织和外周血的单细胞转录组数据整合分析，进而描绘了食管鳞癌微环境中髓系细胞的激活轨迹，这也是不同于之前两篇文章的地方。

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Dinh HQ, Pan F, Wang G, et al. Integrated single-cell transcriptome analysis reveals heterogeneity of esophageal squamous cell carcinoma microenvironment. Nat Commun. 2021;12(1):7335. Published 2021 Dec 17. doi:10.1038/s41467-021-27599-5

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