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2 years ago 优质数据+简单分析=30+CNS子刊？ by 医学僧的科研日记
大家好，我是蟀小伙儿，今天和小伙伴们分享一篇今年1月份发表在CancerCell（一区，IF:31.743）上的高分文章，如果说好的开端是成功的一半，那么在数据挖掘的洪流中，好的数据无疑是冲击高分强大的推动力，一起来看看这篇文章是如何利用自己的数据加上简单的分析发到30+的超高分的吧~
一、摘要
免疫治疗的兴起彻底改变了晚期黑色素瘤的治疗方法，极大的延长了晚期黑色素瘤患者的生存时间。尽管如此，大多数晚期黑色素瘤患者仍然死于该疾病，这主要是由于先天性或获得性免疫治疗抗性所致。不幸的是，对于免疫疗法的抗性机制，目前仍然知之甚少。本文作者通过对77例接受抗PD-1和抗CTLA-4治疗的晚期皮肤黑色素瘤患者的全基因组数据、转录组数据和甲基化数据进行综合分析，探究了可能的耐药机制并评估了新的生物标志物，在黑色素瘤免疫治疗耐药性方面，提出了新的见解。
二、流程图
三、结果简述
1.77例晚期黑色素瘤患者的临床特征
如下图所示，作者收集了77例抗PD-1免疫治疗的晚期皮肤黑色素瘤组织样本，其中包括单独PD-1和PD-1联合IPI两种治疗方式。从活检到免疫治疗开始的中位时间为5.2个月，肿瘤组织主要来自皮下和区域淋巴结。在77例患者中有66例患者的肿瘤发生于非肢端皮肤部位，11例为隐匿性原发性黑色素瘤，患者年龄的中位数为58，其中有51例为男性患者。
2.高肿瘤突变负荷，低结构变异负荷和高新抗原负荷预示更好的免疫反应
首先，作者探索了每个样本的SNV，SV和CNA与免疫治疗反应的关系（下图A）。如图B-D所示，高TMB预示着更好的免疫应答，高SV和高CNA预示着更差的免疫应答。当根据免疫治疗类型进行分类时，PD-1治疗反应与TMB显著相关而IPI+PD-1治疗反应与SV显著相关。高TMB和低SV与免疫治疗后患者的PFS改善显著相关。此外，作者还观察到TMB与新抗原负荷存在很强的相关性（r=0.92，p<0.0001）且高新抗原负荷预示更好的免疫应答（图E-F）。
3.免疫治疗反应和免疫抗性与基因突变无关
接着，作者探索了免疫治疗反应与特定的基因突变的关系。如上图A所示，TCGA分子亚型与免疫治疗反应无关（p=0.24）。为了寻找可能与治疗反应相关的其他突变基因，作者对SNV和小插入缺失进行了全基因组分析，但未发现具有显著意义的基因。同时，作者收集了以往研究中与免疫反应相关的基因，结果表明，它们的突变状态与免疫应答也无显著相关性。
4.干扰素和T细胞受体信号通路在免疫治疗反应组中富集
作者对77个黑素瘤中的53个患者进行RNAseq测序，接着对有无免疫应答的患者进行差异分析，得到205个DEGs，其中一些上调基因先前已被证明与免疫治疗反应相关（CD274，STAT1，IFNG，GZMA，PRF1，GZMB，CD8A等），富集分析结果表明，IFNγ反应通路在免疫应答患者中显著富集（下图A）。
随后，作者对43个样本进行甲基化测序，可能是由于样本量小和肿瘤起源组织的变异性的原因，差异分析仅鉴定到5个差异甲基化CpG位点且这些位点都不在基因启动子中。因此作者重点关注了205个DEGs的甲基化水平。结果显示，有5647个CpG位点被定位到192个DEGs中，173个基因中的1671个CpG位点与表达显着相关。127个基因中的568个探针被定位到启动子区域并与表达负相关，41个基因具有5个或更多个与表达负相关的CpG位点。其中，PSMB8的CpG位点甲基化与表达负相关，且在免疫应答和非应答患者中存在显著差异。
接着，作者分析了与免疫应答相关的基因集的表达水平。如下图B所示，许多基因的表达在免疫应答组和无应答组中存在显著差异，同时，6-基因IFNγ（图C），18-基因IFNγ（图D），效应T细胞（图E），IFNγ/效应T细胞（图F），趋化因子（图G）和TIDE（图H）等基因集的表达在两组中差异显著。
5.黑色素瘤患者的免疫景观
接着，作者通过CIBERSORT计算出免疫细胞浸润丰度，并绘制相应的免疫景观图（下图A）。如下图B-C所示，免疫应答组中M1巨噬细胞和CD8T细胞浸润水平较高，methylCibersort结果与之一致（下图D）。基于PRF1和GZMA的表达水平评估细胞溶解活性，结果显示细胞溶解活性在CD8T细胞激活时上调，在免疫应答组同样上调（下图E）。PRF1和GZMA的低甲基化与高免疫应答有关（下图F）。免疫组化分析表明CD8T细胞与更好的免疫应答相关（下图G），瘤内CD8T细胞表达增加（下图H）。此外，PD-L1表达水平在免疫应答组中更高（下图J）。
6.TMB和IFNg-6评分可以独立预测免疫治疗反应
由于TMB，IFNg-6和CD8+T细胞都与应答有关，作者接下来探究了TMB与IFNγ-6和CD8T细胞的相关性，结果显示，TMB与IFNg-6（r=0.1839，p>0.05）和CD8+T细胞（r=0.114，p>0.05）无关，表明它们是独立的预测因素。
为了进一步验证上面的结论，作者使用53例样本构建了预测免疫治疗反应的回归模型。首先，对TMB，SV，肿瘤纯度等特征进行单因素回归分析，进一步对有意义的特征进行多因素回归分析并构建模型。结果显示，TMB结合IFNγ在所有模型中表现最好（下图A）,高TMB和高IFNg-6的肿瘤显示出对免疫疗法的最佳反应并且预示着更长的PFS（下图B）和更长的OS（下图C），以上结论在验证集中均得到验证（下图D，下下图A,B）。
7.与TMB/IFNγ-6模型预测结果不一致的样本剖析
接着，作者对TMB/IFNg-6双变量模型未正确预测结果的12名患者进行了临床和分子检查，以深入了解其潜在的特异性耐药机制。如图C所示，7例接受了PD1治疗的样本与可以准确预测的患者没有相同的分子特征，第8例样本具有潜在的耐药生物学机制（即JAK3突变），在8个样本中，4例样本高TMB，低IFNγ-6，4例样本的TMB低，IFNγ-6高。
五、总结
在本文中，作者通过对收集的77例黑色素瘤患者的转录组数据，全基因组数据和DNA甲基化数据进行多角度的分析，筛选出了免疫治疗应答的生物标志物，同时结合TMB和IFNγ-6构建并验证了一个稳定的免疫治疗反应预测模型。多组学的综合分析以及内部数据稳定支撑是本文的亮点，也是本文发到30+很重要的因素。整体而言，文章中所涉及的分析难度并不大，如果各位小伙伴手里也有优质数据但不知道怎么用的话，这篇文章有着很高的参考价值~
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