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2 years ago 王炸组合！Perturb-Seq：CRISPR+single cell by 生信人
说到今天的两个配角：CRISPR基因编辑技术和single cell测序技术，那都是大家在近几年科研界耳熟能详的技术了。在如今的各个医学领域，我们都能经常看到由这两种技术主导而发表的CNS主刊，特别是CRISPR基因编辑技术还获得了2020年诺贝尔化学奖。小编觉得未来说不定哪一年单细胞测序技术也可以获得诺贝尔奖，让我们拭目以待！
但是，Immugent今天要说的主角既不是CRISPR基因编辑技术也不是单细胞测序技术，而是它俩的王炸组合--Perturb-Seq技术。这项技术最初是由基因编辑大神张锋和Paola Arlotta在2020年提出，相关文章发表在Science杂志上，这项技术可以同时研究活生物体中许多不同细胞类型中不同基因的功能，有关这篇文章的细节见本文第一个章节。
总的来说，通过基因组测序工作，科学家已经鉴定出大量基因，这些基因一旦发生突变，就会与人类疾病有关。传统上，理解这些基因的作用需要对每个基因进行深入研究。通过开发用于体内应用的Perturb-Seq，我们可以开始以更有效的方式在动物模型中筛选所有这些基因，从而使我们能够从机理上理解这些基因突变是如何导致疾病。废话不多说，下面小编就通过4篇高分文章系统解读一下Perturb-Seq技术的发展和使用。
1. Perturb-Seq的提出
Perturb-seq技术最初由来自Broad研究所的Xin Jin、Aviv Regev、张峰和Paola Arlotta在Science杂志发表的文章In vivo Perturb-Seq reveals neuronal and glial abnormalities associated with autism risk genes中提出，他们研发出一种可以进行体内大规模遗传功能研究的测序技术。
图1：
在这项研究中，研究者首先利用CRISPR-Cas9在35个ASD/ND新发风险基因中引入移码突变，随后转染进子宫内发育的小鼠大脑中，然后对出生后大脑中受到干扰的细胞进行单细胞RNA测序。测序分析从神经元和胶质细胞类中鉴定出细胞类型特异和进化保守的基因模块。这些风险基因的扰动会影响到神经发育过程中反复出现的基因模块和细胞类型，证明这些风险基因对关键细胞过程的影响。很多基因变异在不同的细胞或组织器官里往往能有不同的功能，但传统的bulk RNAseq往往隐没了这些基因在少数细胞的功能。因此，作者建立了活体内的Perturb-seq系统，它可以做到在一个发育胚胎中引入基因编辑来敲除疾病相关的基因，然后两周后在发育后的脑细胞里进行单细胞测序。用这个高通量方法作者就一次性检测了35个自闭症相关基因，并且检测他们在不同的脑细胞中的功能。
图2：
最后，研究人员对现有的人类组织的的scRNA-seq和snRNA-seq数据（包含成人大脑皮质、ASD供体皮质和匹配对照组、胎儿人类皮质以及3个月、6个月大的人脑类器官）进行分析，发现14个基因模块都在人类数据是保守存在的。其中8个模块显示出更多的模块内相关性，而且相关性也随着人类样本的年龄而增加。随后，作者进一步利用现有的数据集定义出ASD病人中不同类型细胞中差异表达的基因，并且在小鼠中发现了有1:1同源类似物的基因共14个。分析显示中间神经元的SST和兴奋性神经元的NRN1在ASD病人中表达降低，与Perturb-Seq试验中表达显著减少相一致。这表明Perturb-Seq技术可以准确的鉴定出人类ASD病人中存在的基因表达异常。
2. Perturb-seq用于癌症编码变体的大规模检测
基因组测序研究已经确定了癌症中数以百万计的体细胞变异，但进一步的预测大多数变异表型所影响仍然具有挑战性。以往区分有影响的变异体的实验方法通常是使用表型检测，这些方法报道了大量细胞群中预定义的基因特异性功能影响。鉴于此，美国罗德研究所的Jesse S. Boehm、Aviv Regev等研究人员，利用Perturb-seq对癌症中的编码变体进行了大规模并行检测。相关研究作为Article在今年发表在Nature Biotechnology杂志上，篇名为：Massively parallel phenotyping of coding variants in cancer with Perturb-seq。
图3：
为了评估癌基因相关变异的功能，研究者对基于sc-eVIP的Perturb-seq技术进行了优化，希望能实现通过外源性的引入DNA条码的方式来标记癌基因中变体，从而可以在单细胞水平的下诱导不同的基因表达状态。如果诱导的基因变体表达与野生型基因相似，则将该类别基因变体称为野生类似型（WT-like），其他情况则认为该基因变体对其功能和表型存在影响。作者们克隆了每个基因变体编码序列，然后加入不同的DNA条码进行标记，对其单细胞水平上的影响进行评估。
图4：
随后，研究者又将Perturb-seq技术应用于对KRAS基因变体功能的评估中，对101个KRAS基因变体的功能进行检测。首先，研究者证实了可以在A549肺癌细胞系中准确区分外源表达的KRAS，随后就对大规模单细胞表达KRAS基因变体在癌细胞系中的表型进行评估。这些KRAS基因变体的表型可以分为野生类型、功能获得型以及功能缺失型突变。功能获得型突变类群变体所存在的位点主要落在KRAS基因的核苷酸结合结构域之中，另外有18个变体处于野生型类似型的基因变体类群之中，但是也会在肿瘤中出现。总之，Perturb-seq技术帮助构建了一种KRAS基因功能或者说表型的渐变状态的衡量方式。
3. Perturb-seq绘制首个人类基因-表型综合图谱
自从单细胞测序技术被商业应用后，我们经常可以在各大杂志的文章中见到各式各样的图谱研究报道。这类文章通常以某一物种或者组织的大量测序数据为基础，通过在单个细胞水平揭示研究对象的细胞亚群构成。Perturb-seq毫无疑问是更强大的，其可以更进一步的在单细胞水平检测出CRISPR sgRNA扰动对基因转录影响的技术。因此，为了建立一个全面理解的细胞功能的图谱，2022年6月9日，美国加州大学旧金山分校Jonathan S. Weissman研究组与纪念斯隆·凯特琳癌症中心Thomas M. Norman研究组合作在Cell杂志上发表了题为Mapping information-rich genotype-phenotype landscapes with genome-scale Perturb-seq的研究。
图5：
为了揭示基因扰动的功能后果和基因型-表型关系，研究人员使用人类血癌细胞系，以及来自视网膜的非癌细胞，对超过250万个细胞进行了Perturb-seq，并使用这些数据构建了一个基因型-表型综合图谱。研究团队根据基因的共同调控将其聚类到特定表达程序中，并计算每个扰动簇中每个基因表达程序的平均活性。分析结果包含多个与基因干扰相关的已知表达程序，包括蛋白酶体功能障碍导致的蛋白酶体亚基上调、 ESCRT蛋白缺失时NF-kB信号通路的激活，以及胆固醇生物合成上调对囊泡运输缺陷的反应等。
图6：
当前，医学领域内一个关键的科学问题，就是如何理解细胞核和线粒体基因组的表达来应对线粒体压力。在这项最新研究中，作者通过实验设计为探究这一问题提供了可能。为了确定基因扰动引起的差异表达模式，研究者检测了单细胞转录组测序数据在线粒体基因组中的分布。为了验证这种基于位置的分析的有效性，首先证实了已知线粒体转录调控因子（TEFM）和RNA降解（PNPT1） 的敲除会导致线粒体基因组位置发生重大变化。相比之下，研究发现许多基因扰动似乎导致了mRNA相对丰度的变化，而不是位置排列的总体变化。鉴于观察到的反应的复杂性，研究人员提出可能有多种机制影响不同线粒体编码转录本的水平，以应对不同的压力。
4. Perturb-seq揭示调控T细胞衰竭的关键基因
在肿瘤免疫领域的研究中，一个很关键的科学问题就是T细胞衰竭。在过去的几十年里，研究人员都在从不同角度去探索这个令人头大的科学问题。2022年6月23日，来自斯坦福大学的Ansuman T. Satpathy 团队同样是利用Perturb-seq技术在Cancer Cell 上发表题为Genome-wide CRISPR screens of T cell exhaustion identify chromatin remodeling factors that limit T cell persistence 的文章。作者通过构建CRISPR筛选体系，揭示了耗竭T细胞中表观遗传学相关染色体重塑和核小体组装的基因是调节耗竭状态的关键基因。
图7：
这项研究的作者开发了一个T细胞衰竭模型，它可以用于研究培养皿中分离的免疫细胞的相关分子机制。众所周知，不断激活分离出来的T细胞受体可以很好地模拟肿瘤微环境中发生的生物过程。然后，研究人员使用CRISPR-Cas9基因编辑技术，在细胞中改变数以万计的基因。他们测试了哪些T细胞在不断激活受体后比平常表现出了更多或更少程度的衰竭。这一目的在于确定哪些基因在触发T细胞衰竭中起着最至关重要的作用。
图8：
研究人员在对调控T细胞衰竭的关键分子进行筛选中，观察到其中Arid1a、Smarcc1 和 Smarcd2是三个最重要的基因，它们都是cBAF复合物的组成分子。特别是将Arid1a敲除后，可以显著阻碍了cBAF复合物的形成，从而进一步提高体内T细胞的持久性和抗肿瘤免疫效力，作者随后在人耗竭T细胞也验证出Arid1a具有同样的抗肿瘤潜力。此外，包括Arid1a在内的cBAF亚基的敲除可以通过限制AP-1转录因子对染色质的可及性来改善T细胞功能，从而抑制与衰竭相关的染色质状态的获得。进一步分析显示cBAF 和 INO80 染色质重塑复合物在T细胞耗竭中具有不同的作用。cBAF主要调节效应和耗竭相关基因，而INO80主要调节代谢。这也表明协同靶向多种途径可以改善T细胞功能。
5.小结
想当初，CRISPR基因编辑技术刚在实验室进行应用时，就使我们具有研究任何一个基因的生物学功能的能力；而随后的单细胞测序技术则是为我们提供了更加精细的、在单个细胞水平的视角，使我们不再会担心因为混杂多种细胞而影响测序纯度的问题。现如今，Perturb-seq技术的兴起则是将这两种革命性技术强强联合，使我们可以在任何细胞上研究任何基因的调控机制。
科技进步之快已经远远超过我们的想象，无论是在工程领域还是医学领域都为我们提供了操作空间。如果说上个世纪的医学科研工作者还会因没有实现精准的检测技术限制当时的科学研究，现如今的医学科技已经基本可以满足我们各种需求，而且我们还可以基于各种需求创造技术。因此，未来医学科研的研究方向不应该是以高新技术为主导，即使它们也很重要，但是更多的科学研究应该以解决重大科学问题为导向。
虽然，小编今天介绍的这个Perturb-seq技术是十分强大的，但是目前还都只是美国的一些大型实验室在使用，未来几年可能也会引入到国内。即便如此，对于一般的实验室来说还是具有很大挑战的，因为进行高质量的CRISPR建库是非常难的。此外值得注意的是，Perturb-seq的数据说到底也是单细胞数据，因此，和其它公共数据一样，我们可以挖掘它们的实验数据来为我们自己的研究进行服务。
[2] Ursu O, Neal JT, Shea E, Thakore PI, Jerby-Arnon L, Nguyen L, Dionne D, Diaz C, Bauman J, Mosaad MM, Fagre C, Lo A, McSharry M, Giacomelli AO, Ly SH, Rozenblatt-Rosen O, Hahn WC, Aguirre AJ, Berger AH, Regev A, Boehm JS. Massively parallel phenotyping of coding variants in cancer with Perturb-seq. Nat Biotechnol. 2022 Jun;40(6):896-905. doi: 10.1038/s41587-021-01160-7. Epub 2022 Jan 20. PMID: 35058622.
[3] Replogle JM, Saunders RA, Pogson AN, Hussmann JA, Lenail A, Guna A, Mascibroda L, Wagner EJ, Adelman K, Lithwick-Yanai G, Iremadze N, Oberstrass F, Lipson D, Bonnar JL, Jost M, Norman TM, Weissman JS. Mapping information-rich genotype-phenotype landscapes with genome-scale Perturb-seq. Cell. 2022 Jun 2:S0092-8674(22)00597-9. doi: 10.1016/j.cell.2022.05.013. Epub ahead of print. PMID: 35688146.
[4] Belk JA, Yao W, Ly N, Freitas KA, Chen YT, Shi Q, Valencia AM, Shifrut E, Kale N, Yost KE, Duffy CV, Daniel B, Hwee MA, Miao Z, Ashworth A, Mackall CL, Marson A, Carnevale J, Vardhana SA, Satpathy AT. Genome-wide CRISPR screens of T cell exhaustion identify chromatin remodeling factors that limit T cell persistence. Cancer Cell. 2022 Jun 17:S1535-6108(22)00231-8. doi: 10.1016/j.ccell.2022.06.001. Epub ahead of print. PMID: 35750052.
END
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