[天祺聊生物]gRNA设计傻瓜式教程

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[天祺聊生物]gRNA设计傻瓜式教程 by 天祺聊生物

       

“ 来到同济医学院有一个多月了，跟着大师兄和师妹们学会了很多理论知识和实验技术，非常感谢大家，最近大师兄要做一个crispr稳敲细胞系，首先就要设计gRNA，本着科研共享的精神，把该方法介绍给大家，祝大家科研顺利！好滴，正文开始了！”

本教程以设计打靶小鼠 IFNGR1基因gRNA为例。

01

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Part1: NCBI寻找IFNGR1全长序列及 cds序列

1. 登录NCBI网站，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ ，输入IFNGR1，点击搜索，进入后在右侧Results by taxon选择Mus musculus

   

2. 选择第一条结果

   

3. 找到Genomic regions, transcripts, and products一栏，选择GenBank

   
   

   

4. Send to 选择fasta得到全长序列，将其在snapgen中（或其他DNA操纵软件）新建文件保存为全长序列

   

5. 在左侧栏中找到mRNA，点击其转录本id

   

6. 进入页面后下滑，点击左侧的CDS

   

7. 选择复制，并在snapgen(或其他DNA操纵软件)新建该序列保存为CDS序列。

   

 

02

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Part 2: UCSC Genome Browser寻找IFNGR1外显子

1. 进入该网址http://genome.ucsc.edu，选择BLAT工具

   
   

   

2. 种属选择mouse，然后将IFNGR1 cds序列粘贴进去，submit

   

3. 选择结果中的评分最高的第一个，点击details

   

4. 结果中蓝色区域即是外显子区域

   

5. 复制外显子序列，在IFNGR1全长序列中搜索， 标记为exon

   
   

03

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Part3: 利用网上在线工具寻找gRNA

1. 在genscript(金斯瑞)公司sgRNA数据库中寻找已经设计好的商业化gRNA ，https://www.genscript.com/gRNAdatabase.html?src=leftbar

2. 在已经标记好exon的IFNGR1全长序列中搜索选中的gRNA, 并进行标记。gRNA全长都要在exon上，其后面紧跟PAM序列。

3. 也可以利用broad研究所的在线工具寻找。https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design，选择好种属后，将CDS序列粘贴进去。

   

4. 下载sgRNA picking sequence, 将数据导入excel，选择原则：

1. 选择综合排名(combined)靠前的，并且剪切位置尽量靠前。

2. 选好后将序列在全长序列中搜索（由于使用该工具时输入了CDS序列，所以有些sgRNA可能是跨越exon gap的，这样的gRNA是不可用的）

3. 构建载体时还要在gRNA前面加一个G

   

   
   

   
   

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以上就是设计gRNA的简单流程了！

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