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“ 来到同济医学院有一个多月了,跟着大师兄和师妹们学会了很多理论知识和实验技术,非常感谢大家,最近大师兄要做一个crispr稳敲细胞系,首先就要设计gRNA,本着科研共享的精神,把该方法介绍给大家,祝大家科研顺利!好滴,正文开始了!”
本教程以设计打靶小鼠 IFNGR1基因gRNA为例。
01
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Part1: NCBI寻找IFNGR1全长序列及 cds序列
登录NCBI网站,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ ,输入IFNGR1,点击搜索,进入后在右侧Results by taxon选择Mus musculus
选择第一条结果
找到Genomic regions, transcripts, and products一栏,选择GenBank
Send to 选择fasta得到全长序列,将其在snapgen中(或其他DNA操纵软件)新建文件保存为全长序列
在左侧栏中找到mRNA,点击其转录本id
进入页面后下滑,点击左侧的CDS
选择复制,并在snapgen(或其他DNA操纵软件)新建该序列保存为CDS序列。
02
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Part 2: UCSC Genome Browser寻找IFNGR1外显子
进入该网址http://genome.ucsc.edu,选择BLAT工具
种属选择mouse,然后将IFNGR1 cds序列粘贴进去,submit
选择结果中的评分最高的第一个,点击details
结果中蓝色区域即是外显子区域
复制外显子序列,在IFNGR1全长序列中搜索, 标记为exon
03
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Part3: 利用网上在线工具寻找gRNA
在genscript(金斯瑞)公司sgRNA数据库中寻找已经设计好的商业化gRNA ,https://www.genscript.com/gRNAdatabase.html?src=leftbar
在已经标记好exon的IFNGR1全长序列中搜索选中的gRNA, 并进行标记。gRNA全长都要在exon上,其后面紧跟PAM序列。
也可以利用broad研究所的在线工具寻找。https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design,选择好种属后,将CDS序列粘贴进去。
下载sgRNA picking sequence, 将数据导入excel,选择原则:
选择综合排名(combined)靠前的,并且剪切位置尽量靠前。
选好后将序列在全长序列中搜索(由于使用该工具时输入了CDS序列,所以有些sgRNA可能是跨越exon gap的,这样的gRNA是不可用的)
构建载体时还要在gRNA前面加一个G
以上就是设计gRNA的简单流程了!
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