盯紧T细胞耗竭，占座明年国自然

盯紧T细胞耗竭，占座明年国自然 by 生信人

昨天国家自然科学基金委员会官网公布了《关于2022年国家自然科学基因集中接受申请项目评审结果的通知》，具体结果如下

杰青 415项，优青630项，港澳优青25项，面上20472项，青年22262项

生信人的小伙伴们有没有中奖的？今年的特点是杰青的资助量较去年显著上涨，足足增长了32.16%，充分显示的国家对青年科研力量的重视！

好了，公布完这个振奋人心的喜讯，我们还得踏踏实实搞科研，还记得之前小编给大家分享的T细胞耗竭专题吗，小编敢讲这个方向明年国自然必有一席之地。今天就接着给大家分享一篇T细胞耗竭方向的高分单细胞研究。

T细胞耗竭个性化生信思路扫码抢占

胃癌(gastric cancer, GC)包括许多分子亚型，是全球第五大常见恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第三大原因。已经有研究发现胃癌肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)对其发生发展起到至关重要的调控作用，因此小编今天就和大家分享一篇今年8月刚刚发表在Nature Communications（IF:17.694）杂志上刻画胃癌TME的单细胞分析文章，文章对胃癌微环境中的细胞通讯进行了研究并揭示了不同的T细胞耗竭轨迹，是一篇十分值得参考的使用单细胞数据研究肿瘤微环境的文章！

胃癌单细胞测序揭示复杂的细胞间相互作用与不同的T细胞耗竭轨迹

研究背景

尽管早期胃癌有较高的治愈率，但大多数胃癌患者被发现时已处于晚期或转移期，他们的预后相对较差。此外，虽然目前针对PD-1和CTLA4的免疫治疗已经转变了许多癌症的治疗模式，但其在胃癌中的应答率仍然相对较低，因此迫切需要对胃癌进行深入研究来开发有效的治疗策略。许多先前的研究已经发现肿瘤的异质性和细胞组成的个体差异与生存密切相关，而单细胞RNA测序(scRNA-seq)能够在更高的分辨率下解析GC的微环境，因此这篇文章作者就应用scRNA-seq来绘制GC的免疫、基质及上皮细胞的转录景观并进行了细致分析，希望能够贡献于GC肿瘤微环境和生物学特性的研究以及GC干预措施的开发。

文章摘要

研究对10例胃癌患者的肿瘤、癌旁组织及血液样本的166533个细胞进行分析，发现肿瘤相关基质细胞(TASCs)的Wnt信号和血管生成活性上调，并且与生存呈负相关。研究也发现肿瘤相关巨噬细胞和LAMP3+ 树突状细胞（DC）能够参与介导T细胞活性，并与TASCs细胞相互作用。克隆型和轨迹分析则发现Tc17 细胞(IL-17+ CD8+ T细胞)起源于组织驻留的记忆T细胞，并会分化为耗竭T细胞，这揭示了T细胞耗竭的另一种轨迹。研究也发现IL17+细胞可能通过IL17, IL22和IL26信号通路促进肿瘤进展。

主要内容及结果

胃癌微环境的单细胞图谱

在文章的第一部分作者在单细胞分辨率下对胃癌(GC)的细胞类型多样性进行了研究。研究纳入10例未经治疗的原发性GC患者，并使用从肿瘤组织、外周血及癌旁组织中分离出的细胞构建了单细胞测序谱(图1a)。此外，作者也对样本组织进行了全外显子测序(WES)和RNA测序。在整合患者表达谱及质控后，研究最终保留了166533个细胞(图1b)。接下来，作者将这些细胞划分为属于免疫细胞、基质细胞和上皮细胞的12个谱系(图1b-d)，观察到几乎所有细胞类型均在每个患者中都有发现，其中大部分来源于患者GC07、GC08和GC10（图1e）。研究也获取了配对的TCR和BCR (T/B细胞受体)测序数据，来研究不同T或B细胞亚型内的状态转换。

图1 利用scRNA-seq研究胃癌肿瘤微环境

GC中的恶性细胞表现出广泛的异质性

在文章的第二部分，作者对GC中的恶性细胞进行了分析。作者首先提取上皮细胞并重新聚类，并根据肿瘤和正常组织的特征基因表达情况计算的肿瘤评分(图2a)，及通过inferCNV计算细胞的拷贝数变异(CNV)得分(图2b)，以及通过比较肿瘤组织与癌旁组织的WES数据识别的肿瘤特异性突变(图2c)，同时结合细胞类型特异性基因的表达模式(图2f)，定义了正常簇、肿瘤细胞簇（图2d）。接着作者研究了同一例患者组织测序数据是否有相似的基因表达模式，结果发现scRNA-seq和组织RNA-seq数据基因表达高度相关(图2e)。接下来，作者研究了肿瘤和癌前病变簇的基因表达模式，发现CLDN3、CLDN4和CLDN7在肿瘤细胞和肠化生（IM）细胞中异常高水平表达(图2f)，且高变异基因平均表达量的相关性分析也表明Tumor_GC07和Tumor GC10簇彼此接近(图2g)。此外，作者结合(Genotype-Tissue Expression, GTEx)数据也发现其共享一些食管黏膜肿瘤的特异性差异基因（DEGs）(图2h, i)，且他们在除Tumor_GC08_1外的肿瘤簇中均表达下调(图2j, k)。

图2 单细胞水平分析胃癌上皮细胞

识别驱动肠化生(IM)的潜在调控因子

由于上述识别到了IM簇，因此在这一部分作者对患者的IM进行了分析。作者首先根据细胞类型特异基因计算了单细胞簇及组织中杯状细胞和肠细胞评分(图2l, m)，结果发现GC08和GC09肿瘤样本和癌旁样本中均有较高水平的IM。接着作者对驱动IM的潜在调控因子进行研究，来寻找与IM的主转录因子CDX2表达相关的基因，结果发现CDX2高度相关的基因包括已知的CDX2靶点，如GUCY2C、CDH17、SI和GPA33等(图2n)。此外，作者还用胃癌细胞系进行过表达实验，发现HOXA13可以上调CDX2。

GC中机制组成经历了大量重塑

在这一部分，作者对胃癌TME中基质细胞的功能进行了分析。首先重新聚类了所有的基质细胞，结果发现癌旁和肿瘤组织之间有明确分离，这表明TME中的基质细胞与癌旁组织中相比发生了全面的转录组学变化(图3a)。然后，作者将这些基质细胞分为12个不同的簇，发现Endo_1、Fib_1和SMC_1主要富集在肿瘤组织中(图3b)。作者也发现胃中内皮细胞表达主要组织相容性复合体(MHC)ⅱ类基因，如HLA-DRA和HLA-DRB5(图3c)，这一点也被胃癌患者肿瘤切片的免疫组织化学(IHC)染色证实(图3d)。

此外，作者也发现Endo_1具有下调的MHCⅱ类基因(图3f)，进一步对另外9个GC患者样本进行了流式细胞术也发现肿瘤旁组织中MHC II类内皮的比例高于对照组（图3g）。同样，作者进行了IHC染色，来验证肿瘤中FAP+成纤维细胞和内皮细胞的存在(图3e)。作者也发现Wnt信号通路中的基因如WNT2和WNT5A在肿瘤成纤维细胞中上调，而抑制Wnt信号通路的SFRP1下调(图3i)。这些基因在TCGA-STAD数据集中也显示出相似的表达模式(图3j)。

作者也观察到促进肿瘤生长和血管生成的BMP1和ANGPT2在SMC_1中表达水平显著升高，免疫组化结果也证实这一点(图3h)。此后，作者将三种肿瘤富集细胞簇Endo_1、Fib_1和SMC_1中的细胞定义为肿瘤相关基质细胞(TASCs)。作者观察到，肿瘤进展的关键标志血管生成通路在TASCs中显著上调(图3k)。然后，作者研究了TCGA-STAD数据集中TASCs的比例和患者生存期之间的潜在关联，结果发现Fib_1和SMC_1均与较差的预后相关(图3l)。此外，体外实验还表明，CAFs来源的上清液对几种胃癌细胞系具有支持肿瘤生长的能力(图3m)。综上所述，作者推测TASCs在胃癌中发生了显著的重塑并显示出潜在的促癌特征。

图3 GC中基质细胞的动态重构

脂质相关巨噬细胞在肿瘤中富集

髓系细胞是高度异质性的免疫细胞群，对TME的形成起重要作用，因此在这一部分作者对髓系细胞进行了进一步分析。作者首先将GC TME中的髓系细胞聚类为8个不同的细胞簇，包括2个单核细胞簇、2个巨噬细胞簇和4个树突状细胞(DCs)簇(图4a, b)，发现巨噬细胞簇Mφ_APOE共表达M1和M2巨噬细胞的特征(图4c)。通过识别Mφ_APOE和Mφ_THBS1之间的DEGs，作者发现脂质相关基因(APOE, TREM2)和溶酶体基因(GRN, CD63, LAMP1)在Mφ_APOE中高表达，并且在肿瘤中特异性升高(图4d, e)，表明脂质相关和溶酶体功能是GC中巨噬细胞的关键标识(图4c)。作者也发现MITF, NR1H3和TFEC在Mφ_APOE中特异性上调，并且这些调控因子也表现出与脂质相关基因和溶酶体基因表达相似的模式(图4f)。

此外，作者发现与对照组相比TFEC及NR1H3过表达显著上调了巨噬细胞中APOE和APOC1的表达(图4g)。除了cDC1_XCR1、cDC2_CD1C和pDC_LILRA4三种传统的DC细胞类型，作者还识别了一种非经典的DC细胞类型DC_LAMP3，其特征是LAMP3和CCR7的特异性表达(图4b)。作者基于RNA速率分析认为LAMP3+DC可能来源于cDC2(图4h)，且作者也发现虽然cDC2_CD1C细胞LAMP3和CCR7表达水平极低，但LAMP3和CCR7的未剪切RNA相对较高(图4I)。

图4 分析髓系细胞发现肿瘤组织中脂质相关的巨噬细胞扩张

大多数胃肿瘤的TME中都存在Tc17细胞

在这一部分作者对GC中T细胞的多样性进行了分析，首先提取了具有scRNA-seq数据和配对TCR信息的T细胞，并将其重新聚类为10个CD8+簇、6个CD4+簇、3个CD4+ Treg簇和1个代表T细胞当前在细胞周期中进展的循环簇(图5a-c)。作者观察到10例患者中，有8例CD8+ IL17+ T细胞占肿瘤浸润T细胞总数的1%以上，且多色IHC染色也证实了胃癌TME中CD8+ IL17+ T细胞的存在(图5d)。

作者通过富集分析也发现CD8_C8_IL17A中上调的基因显著富集于Th17细胞分化和炎症性肠病(IBD)通路(图5e)，这表明CD8_C8_IL17A和Th17细胞在胃癌TME中可能存在功能重叠。由于CD8_C8_IL17A细胞的这些特征与Tc17细胞相似，因此作者将这一簇细胞命名为Tc17。此外，作者也观察到T细胞簇显示出不同的组织分布模式(图5b)。

图5 T细胞的解析和聚类识别GC生态系统中多种不同的功能状态和基因模块

Tc17和Th17细胞可能通过IL17/22/26信号通路促进胃癌的生长

这一部分作者试图通过体外实验了解Tc17细胞在胃癌中的功能，结果发现从胃癌中分离的Tc17细胞可刺激肿瘤细胞产生CXCL12，进而招募髓源性抑制细胞(MDSCs)，从而抑制细胞毒性CD8+ T细胞。此外，作者也发现多个Tc17细胞显著上调基因能够促进肿瘤进展，它们的受体也在肿瘤细胞中上调(图5g)，且TCGA-STAD数据中也发现这些受体在肿瘤组织中高表达(图5h)。因此，作者假设在胃癌中IL17+ T细胞可以通过IL17, IL22和IL26信号通路促进肿瘤生长。

用TCR分析解析T细胞亚型的状态转变

在这一部分作者试图通过TCR克隆信息和伪时序分析来解析不同亚型T细胞之间的细胞状态转换。作者观察到T细胞中识别的36239个克隆型中，有30980个克隆型仅检出1次(唯一TCR)， 5259个克隆型检出2个或2个以上(非唯一TCR)，个体克隆群体大小从1到569(图6a)。作者也观察到除naïve CD8+ T细胞(CD8_C1)外，CD8+ T细胞簇的克隆扩张程度均高于CD4+ T细胞簇(图6b)。

研究也发现CD8_C2(效应细胞)、CD8_C3(细胞毒性)、CD8_C4(效应细胞记忆)和CD8_C10 (MAIT)簇的克隆细胞比例较高(图6c)，且在高克隆簇中，CD8_C2多来源于血液，其标记基因富集在细胞迁移相关通路中(图6d)，因此作者推测CD8_C2具有从血液渗入组织的潜力。作者也发现相同克隆型的T细胞更有可能聚集在同一簇或密切相关的簇中(图6e、f)。通过单细胞TCR测序数据作者根据每个T细胞簇内的TCR基因使用情况将T细胞簇嵌入到一个3D空间(图6g)，嵌入空间也表明CD8+ T细胞比CD4+T细胞显示出更大的异质性。

接下来作者根据配对细胞簇共享的TCR克隆型的比例计算了克隆型共享矩阵，来评估它们谱系中的关系(图6h)，结果观察到与CD8+ T细胞相比，CD4+ T细胞的克隆型共享矩阵稀疏，因为CD4+ T细胞的克隆扩增要低得多(图6b)。作者根据克隆型共享矩阵(图6h)以及血液和组织之间的共享比例(图6c)的差异，假设了T细胞状态转换的两种可能轨迹(图6i)：一个轨迹为来源于CD8_C2(效应细胞)的CD8_C3(细胞毒性)细胞转变为CD8_C4(效应记忆)或CD8_C9(耗竭)细胞；另一个轨迹为来源于CD8_C5 (驻留)的CD8_C8 (Tc17)细胞转化为CD8_C9(耗竭)细胞。

图6 基于TCR共享和轨迹分析的CD8+ T细胞表型转变

驻留CD8+ 通过Tc17参与T细胞耗竭轨迹

在这一部分作者对这些簇间的分化轨迹进行了进一步分析，首先在每个轨迹的簇中提取了共享相同克隆型的细胞，然后使用RNA速率分析来研究扩散图的方向性(图6j, k)，结果发现了一个来源血液的CD8+ T细胞通过CD8_C3(细胞毒性)细胞流向耗竭簇的强定向流(图6j)。沿着这条耗竭轨迹，T细胞的杀伤分数逐渐降低，耗竭分数逐渐升高(图6l, m)。且RNA速率显示，组织驻留的CD8+ T细胞也通过Tc17细胞向耗竭群体定向流动(图6j)，表明组织驻留的CD8+ T细胞在TME中分化为Tc17细胞，进而产生耗竭表型。因此，作者将T细胞耗竭的两种轨迹命名为"细胞溶解耗竭轨迹"和" Tc17耗竭轨迹"。尽管最终都达到了耗竭状态，但作者发现Tc17耗竭轨迹的耗竭评分与细胞溶解耗竭轨迹相比显著升高(图6)。此外，尽管经历了广泛的克隆扩增，Tc17在非naïve CD8+ T细胞中的细胞溶解评分最低(图6b)。总体而言，细胞溶解评分沿着细胞溶解耗竭轨迹降低，而沿着Tc17耗竭轨迹增加(图6)。

不同的转录程序与两种耗竭轨迹相关

在这一部分，作者对上述这两种耗竭轨迹相关的转录程序进行了研究。作者推测Tc17细胞和细胞毒性T细胞可以产生两种不同类型的具有不同转录程序的耗竭T细胞，且差异基因分析也表明，Tc17来源的耗竭T细胞高表达KRT86，而细胞溶解来源的耗竭T细胞高表达GZMK(图7a、b)。为了研究驱动这两个轨迹不同转录程序的潜在机制(图7c)，作者重点分析了在这两条轨迹中差异表达和激活的转录因子(TFs)的动态变化，使用SCENIC识别沿两种轨迹有差异激活的TF(图7d)。通过SCENIC，结合伪时序和基因表达分析，作者发现与Tc17耗竭轨迹相比，EOMES及其下游靶点的表达在细胞溶解耗竭轨迹中均较高(图7c-f)。同样，由于这些因子及其下游靶点的高表达，RUNX2被确定为Tc17耗竭轨迹中的潜在关键调节因子(图7c-f)。综上所述，作者识别了两个衰竭过程中不同的调控程序，并确定了两个过程的潜在关键调控因子。

图7 TF活性沿T细胞衰竭轨迹的动态变化及IL17+ T细胞对胃肿瘤的潜在促进作用

肿瘤相关的基质细胞和髓细胞是复杂的细胞相互作用的关键介质

在这一部分作者对参与胃癌的各种细胞类型之间复杂的通讯网络进行了分析。作者通过CellPhoneDB识别了肿瘤和正常组织中的细胞相互作用，发现涉及TASCs和巨噬细胞的相互作用主导了TME网络。作者观察到Fib_1表达了大量肿瘤细胞的生长因子，Endo_1强激活TNF、VEGF、PDGF、PGF和Notch信号通路(图8a, b)。通过进行各细胞类型之间的相关性分析，作者也发现研究数据集和TCGA-STAD队列中，TASC亚型的比例都是高度正相关的(图8c)。此外，作者通过体外共培养实验发现CAFs分泌的某些细胞因子可以诱导THP-1单核细胞来源的巨噬细胞进入GC TME中的巨噬细胞状态，上调Mφ_APOE和Mφ_THBS1标记基因(图8 d)，且Mφ_APOE评分呈持续上升趋势，而Mφ_THBS1评分在诱导过程中呈现轻微变化(图8e)。接下来，作者研究了TME中与淋巴细胞相关的显著相互作用(图8f)，并通过多色IHC染色证实了胃癌患者肿瘤切片上NECTIN2-TIGIT相互作用的存在(图8f)。

图8 细胞-细胞相互作用网络是肿瘤进展的重要途径

到这里，这篇文章的主要内容就结束了。文章构建了一个全面的胃癌单细胞转录组图谱，刻画了免疫亚群，基质亚群和上皮亚群的详细和复杂的分类，并进一步阐明了它们的分子特征和细胞间通讯，并识别出不同的T细胞耗竭轨迹。文章内容丰富，逻辑严谨，对每个结果都从多个角度进行了分析验证，无论是方法还是内容都值得小伙伴们参考学习。

副推给大家罗列了T细胞耗竭相关知识点和思路的汇总，感兴趣的小伙伴赶紧学起来，下一年国自然说不定就花落你家啦

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撰稿 ▎jing

排版 ▎XX

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盯紧T细胞耗竭，占座明年国自然 #2712

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