ixxmu
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1 year ago 文献详解丨肿瘤与免疫细胞互作好比锁钥特征？这篇NC文章把scRNA-seq玩出来了新花样 by i生信
小编最近很青睐Nat Com上发表的单细胞研究文章，思路看似简单又可圈可点，是单细胞研究入门之后升级打怪的好教材。一起来看看今天这篇文章是如何玩转scRNA分析的！文章标题：Multiregional single-cell dissection of tumor and immune cells reveals stable lock-and-key features in liver cancer.
大量研究表明，实体恶性肿瘤在表型和遗传水平上具有显著的肿瘤内异质性（ITH），ITH可能来自于肿瘤恶性细胞的进化及其与肿瘤微环境（TME）的持续相互作用，影响着患者预后。由于肿瘤的演化伴随着肿瘤细胞和TME的不断相互作用，因此，定义恶性细胞和免疫/基质细胞的相互作用可能代表了其肿瘤生物学的独特特征，这一特征类似于前人提出的描述酶-底物相互作用的锁-钥模型。
在这项研究中，作者旨在通过对7名肝癌患者的多区域单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析来比较、探究肿瘤内及肿瘤间异质性，并确定肿瘤恶性细胞和TME的组成及互作网络，并在另外肝癌患者的单细胞数据中验证其结果。最后还用bulk RNA数据及多重荧光原位杂交实验，验证与预后相关的互作关系对的稳定性和预后价值。
1.肝脏多区域scRNA-seq探究肿瘤内和肿瘤间异质性
为了确定肿瘤细胞和TME的空间分布以及它在每个肿瘤内的稳定性，作者对4名原发性肝癌（HCC）和3名肝内胆管癌（iCCA）患者的不同肿瘤大小的肝脏肿瘤标本进行了多区域单细胞转录组测序（scRNA-seq）。多区域具体指的是每个肿瘤标本的五个独立区域，即三个肿瘤核心区（T1、T2和T3）、一个肿瘤边界（B）和一个相邻的正常组织（N），共有34个样本被纳入研究。
然后基于恶性细胞群鉴定结果发现，在肿瘤的不同区域，肿瘤恶性细胞形成了患者特有的集群，表明区域间异质性比肿瘤间异质性小得多。虽然每个病例的多个区域的恶性细胞聚集在一起，但每个肿瘤的不同区域之间的肿瘤组织学具有明显差异。此外，通过染色体拷贝数变异（CNVs）分析发现患者之间的差异（肿瘤间异质性）远大于肿瘤内异质性。
2.探究恶性和非恶性细胞的转录组异质性的动态变化
为了评估来自不同区域的恶性细胞的转录组异质性及分化轨迹，作者利用 RNA velocity对恶性细胞进行轨迹分析。结果显示恶性细胞的细胞轨迹在每个肿瘤内的不同肿瘤区域中是相似的。其中病例1C样本的恶性细胞沿其分化轨迹对细胞干性相关基因（即EPCAM、KRT19、ICAM1）和肿瘤进展相关基因（即SPP1）的表达进行排序时，发现在采样区域之间有类似的基因表达模式，而且在其他案例中也发现了类似的结果。
接下来作者通过降维聚类和细胞群鉴定，确定了HCC和iCCA的肿瘤微环境细胞组成，包括T细胞、B细胞、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）、肿瘤相关内皮细胞（TECs）、肝细胞和胆管细胞。值得关注的是，当每种细胞类型被单独分析时，每个病例中来自不同区域的T细胞有很高的相关性，这表明T细胞的转录组图谱在不同的区域中很稳定，而CAFs、TECs、TAMs和B细胞的相关性在不同的区域有所不同。
3.构建多区域肿瘤-免疫通信网络
由于肿瘤的发展是一个动态过程，涉及到肿瘤恶性细胞和基质/免疫细胞的持续互作，恶性细胞可能会深刻影响肿瘤微环境中的各种细胞类型，以促进其自身的生存和传播。为了确定恶性细胞的通信网络，作者使用CellPhoneDB搜索了每个病人体内恶性细胞和TME的配体-受体相互作用，确定了病人特有的相互作用网络。结果表明，在不同的取样区域，分子通讯网络相对稳定，这可能反映了每个肿瘤内在的肿瘤生物学特性。值得注意的是，HCC中的相互作用比iCCA更稳定。与特定病人内不同肿瘤区域的一致性相比，不同病人的配体-受体相互作用对有所不同，显示出每个病人特有的细胞间通讯网络。，而且这种独特性主要由恶性细胞决定。综上所述，每个肿瘤可能含有相对稳定但独特的肿瘤和TME之间的通信网络，其中恶性细胞对病人的特定模式具有主要贡献。
4.肿瘤-免疫通信网络与患者预后相关
为了确定患者特定的肿瘤-免疫相互作用网络是否具有重要的生物学意义，作者对另外肝癌肿瘤样本（包含HCC和iCCA患者）的scRNA数据进行恶性细胞和非恶性细胞的配体-受体相互作用分析。基于多区域分析中发现的具有稳定互作关系的配体-受体对，作者将基于具有不同相互作用网络的患者分为两个cluster。值得注意的是，这两个cluster组间患者具有明显不同的总生存期。
为了确定每个cluster的关键互作关系，作者评估了每个配体-受体相互作用的比例在两个cluster中的差异。结果发现LGALS9-SLC1A5和SPP1-PTGER4主要是由恶性细胞和TAMs的互作，是cluster1中最重要的交互关系对。进一步用CellChat来确定细胞的相互作用，发现使用两种方法得到的恶性细胞和TAMs之间的配体-受体相互作用（即SPP1-PTGER4和LGALS9-SLC1A5）具有一致性，这表明所确定的配受体对是稳定的。
为了进一步验证特定的配体-受体相互作用网络是否与HCC患者的总生存期有关，作者将从单细胞分析中发现的配体-受体对应用于三个HCC队列的bulk RNA数据中，探究其与患者的预后关系。作者通过计算特定配体受体对的平均值与所有配受体表达中位数的比值来确定这对配体与受体在肿瘤和TME之间的相互作用，进而生成每个病人的相互作用图，然后在此基础上进行分层聚类。结果发现患者可以被分为两个主要的群组，并且这两个群组患者的总生存期具有显著差异。总之，这些结果意味着每个肿瘤微环境中包含肿瘤-免疫/基质相互作用对的独特组合，这类似于酶-底物相互作用的锁-钥模型，这些相互作用可以作为肿瘤侵略性的分类器加以利用。
5.通过多重原位杂交验证HCC中的关键配体-受体对
接下来作者使用RNAscope多重荧光原位杂交法确定代表肿瘤-TAM互作关系对（即LGALS9SLC1A5和SPP1-PTGER4）在两个HCC队列的石蜡组织中的表达模式。结果显示这四个目标基因的表达水平都有明显的相关性。此外，与单细胞和bulk RNA数据一致，在两个HCC队列中，两对基因高表达的患者的总生存期明显比低表达组的患者差。因此，两个配体-受体对（LGALS9-SLC1A5和SPP1-PTGER4）的共存是稳定的，其表达量的升高与HCC患者的预后不佳有关。
6.探究具有独特肿瘤-巨噬细胞互作的肿瘤生物学特征
为了探索与这种独特的肿瘤-巨噬细胞互作的生物学特征，作者比较了有或没有LGALS9-SLC1A5和SPP1-PTGER4存在的肿瘤的TAMs的单细胞转录组特征，发现有4种主要的TAMs亚型，即c1（增殖型）、c2（炎症型）、c3（修复型）和c4（CLEC9A+WDFY4+）。其中c1和c4 TAMs在有配对的肿瘤中富集，而c2和c3 TAMs在没有配对的肿瘤中富集。通过比较有或没有特定配对的TAMs或恶性细胞中寻找差异表达基因发现，有配对的TAMs富含涉及氧化磷酸化的基因，而有配对的恶性细胞富含干扰素反应途径的基因。总的来说，这些结果表明存在一种独特而稳定的肿瘤-巨噬细胞信号传导途径，代表了与HCC侵袭性相关的特定配体-受体相互作用的下游的独特特征。
文章标题很吸引人，lock-and-key Features（锁-钥特征），但该说不说，锁-钥特征在文章只是一笔带过，原来NC文章也可以“标题党”。小编私以为该文章分析亮点在于通过自己开发的简单算法将单细胞分析得到的配受体互作网络结果应用到bulk RNA数据中，进而可以挖掘特定配受体对与患者的预后关系，可借鉴！
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