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CRISPR/Cas9基因编辑在癌症中的应用现状及未来展望 #3150

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CRISPR/Cas9基因编辑在癌症中的应用现状及未来展望 by 医学僧的科研日记

今天和大家分享一篇于2022年2月发表在Molecular Cancer上的综述文章"Current applications and future perspective of CRISPR/Cas9 gene editing in cancer",CRISPR/Cas9基因编辑在癌症中的应用现状及未来展望。这篇文章主要介绍了CRISPR/Cas9基因编辑的基本原理、CRISPR在揭示肿瘤发生、转移和耐药机制方面的进展、CRISPR/Cas9系统的传递载体及临床应用,下面我们一起来学习一下~


一、文章前言

环境中有很多病毒威胁着原核生物的生存。作为一种防御机制,原核生物开发了一种适应性免疫系统,称为聚类调节间隔短回文重复序列(CRISPR)。CRISPR基因座由来自噬菌体和其他染色体外元件的间隔体组成,由编码小的非信使RNA的短重复序列分开。这些间隔子可以防止原病毒株的感染,并且具有适应性——细菌在病毒攻击后从噬菌体基因组中整合一个新的间隔子,消除或添加特定的间隔子改变细菌的噬菌体抗性。此外,在CRISPR位点附近还有4个CRISPR相关(cas)基因。

CRISPR/Cas介导的适应性免疫发生在三个步骤中(图1)。
1.原核生物获得入侵病毒或质粒的细胞记忆。感染后,来自入侵者的DNA序列作为间隔阵列整合到宿主CRISPR位点中,两侧是重复序列,根据序列提供特异性噬菌体抗性。
2.RNA聚合酶从CRISPR位点的间隔区域产生RNA,称为pre-CRISPR RNA(pre-crRNA)。在前crRNA转录的同时,转录来自CRISPR位点上游的反式激活crRNA(tracrRNA)以发挥两个基本功能:诱导RNase III酶的前crRNA成熟,以及激活crRNA引导的DNA切割。然后,tracrRNA:crRNA复合物加载到CRISPR相关核酸酶9(Cas9)上,形成活性核糖核蛋白(RNP)复合物。
3. 双链RNA结构指导Cas9在与crRNA间隔序列互补的位点在DNA中引入双链断裂(DSB)。CRISPR和Cas9共同在细菌对噬菌体感染和质粒偶联的抗性中发挥协同作用。

图1 II型CRISPR/Cas9系统的机制

改变CRISPR/Cas9的靶标只需要改变引导RNA序列;这促使CRISPR/Cas9基因组编辑系统作为修改各种细胞类型和生物体遗传物质的工具(图2)。

图2 CRISPR/Cas9系统发展简史及相关基因编辑工具


CRISPR/Cas系统包括3种主要类型(I型、II型和III型)和12种亚型(表1)。与I型和III型相比,II型系统依靠单个Cas蛋白精确靶向特定的DNA序列,因此成为最常用的基因组编辑工具(表1)。本文主要讨论II型系统。

表1 三种CRISPR-Cas系统的比较

此外,tracrRNA: crRNA结构可以是单个向导RNA(sgRNA),它简化了CRISPR系统的组件,并允许Cas9通过改变sgRNA序列来靶向任何DNA序列,只要它与原间隔相邻基序(PAM)相邻。PAM是一个短序列基序(2-5 bp),与入侵DNA上的crRNA靶向序列相邻。sgRNA-Cas9对DNA的初始结合和切割需要PAM识别。没有PAM,即使Cas9与sgRNA完全互补,也无法切割靶序列。这些基序在I型和II型CRISPR系统的DNA干扰过程中也被识别,PAM相互作用触发Cas9活性。

下面介绍一下文章的基本结构:

二、CRISPR新一代技术

尽管CRISPR/Cas9在疾病治疗方面显示出光明的前景,但它依赖DSB刺激基因编辑过程可能会破坏其安全性。由CRISPR/Cas9介导的DNA断裂可以删除数千个碱基对并产生新的基因型,其中一些可能在有丝分裂活性细胞中产生潜在的致病后果。例如,人类多能干细胞中的CRISPR/Cas9基因组工程可以产生p53突变,限制了细胞替代疗法的潜在应用。

然而,单核苷酸多态性(SNPs)是大多数已知遗传疾病的主要原因。因此,需要在不引入DSB的情况下特异性改变目标位点上单个碱基对序列的方法。在这里,我们回顾了两种最新的此类技术:碱基编辑器和先导编辑器。

胞嘧啶碱基编辑器CBE

CBE由三个基本单位组成:胞苷脱氨酶,尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)抑制剂(UGI)和部分无活性的Cas9(nCas9)或dCas9。SgRNA引导Cas9变体靶向特定序列以产生单链而不是DSB,而碱基脱氨酶催化脱氨反应以启动碱基编辑。由于碱基切除修复酶UDG对U•G中间体的尿嘧啶切除水平较高,会导致碱基切除修复途径恢复到原始C•G碱基对,而UGI可以有效阻断人类UDG的活性,因此在引入UGI可以保护U•G对中间体,并将碱基编辑效率提高约三倍(图3a)。

腺嘌呤碱基编辑器ABE

人类已知致病性SNP中有一半是由胞嘧啶的自发脱氨引起的,但所有现有的碱基编辑器都介导C•G向T•A的转化。腺苷脱氨产生肌苷,肌苷通过复制和转录机制被读取为鸟嘌呤。基于上述原理和CBEs的研究基础,Liu和他的团队开发了与CBEs具有相似的结构和编辑机制的ABE,但用腺苷脱氨酶取代胞苷脱氨酶。与CBE不同,添加DNA修复操作组件(如UGI)是不必要的,因为细胞内肌苷切除的效率远低于尿嘧啶(图3b)。

碱基编辑器的优缺点

优点:碱基编辑精确地产生特定的单核苷酸变化;它避免了核酸骨架裂解引起的DSB,但直接化学修饰了靶碱基,显著提高了产物纯度并减少了插入缺失。此外,碱基编辑避免了Cas9核酸酶引起的p53活化,并将DSB的不良后果降至最低。

缺点:然而,碱基编辑者必须在~4-10个核苷酸的狭窄窗口内区分靶碱基和周围碱基,以实现精确编辑。此外,腺嘌呤碱基编辑偶尔会引起周围的胞嘧啶脱氨。与传统的基因组编辑一样,碱基编辑的另一个潜在问题是脱靶效应。对于碱基编辑的临床应用,脱靶效应可能是促进肿瘤发生的主要因素。


先导编辑 Primeediting 

先导编辑器由连接到逆转录酶的nCas9(HNH核酸酶失活)和修饰的sgRNA组成,称为先导编辑指南RNA(pegRNA)。pegRNA不仅结合特定的DNA序列,而且还包含新的遗传信息作为合成新DNA链的模板。在pegRNA的指引下,先导编辑器首先与特定的靶DNA序列结合,Cas9 RuvC核酸酶结构域切开含有PAM的DNA链。为了将编辑后的序列从pegRNA转移到靶DNA上,逆转录酶读取RNA并将相应的碱基附着在切口DNA的末端,然后DNA修复机制将新链稳定地引入靶位点(图3c)。先导编辑理论上可以纠正大多数与人类遗传疾病相关的基因突变,为临床治疗中的基因组编辑奠定基础。

先导编辑器的优缺点

优点:首先,先导编辑没有限制的编辑窗口,可以介导所有可能的碱基转换和转化,提供了一种将新的DNA序列引入特定基因组位点的方法,同时避免DSB。其次,该方法具有高度特异性,几乎没有脱靶效应。最后,与核酸酶介导的HDR(同源定向修复)相比,编辑结果具有更少的插入缺失。

缺点:尽管先导编辑已成功应用于四种人类细胞系和原代有丝分裂后小鼠皮质神经元,但由于未知因素,编辑效率各不相同。

图3 先导编辑器和碱基编辑器的机制。
a. 胞嘧啶碱基编辑器(CBE)使用胞苷脱氨酶与其同源碱基结合以催化脱氨反应并将R环中的胞嘧啶转化为尿嘧啶。由此产生的U•G碱基错配在DNA复制或修复后转化为T•A对。
b. 腺嘌呤碱基编辑器(ABE)示意图。ABE介导的脱氨将腺苷转化为肌苷,随后在DNA复制过程中被读取为鸟嘌呤。
c. 先导编辑器结构及先导编辑机制示意图。

三、通过CRISPR/Cas9筛选发现靶标

体外体内CRISPR筛选示意图:


图4 体外或体内CRISPR筛选示意图。
a. CRISPR筛选首先合成含有单个向导RNA(sgRNA)序列的寡核苷酸池,并将其克隆到慢病毒载体中。然后慢病毒以低感染倍数感染表达Cas9的细胞。选择后,池中含有具有不同基因敲除的细胞,随后可用于各种筛选方法。
b. 体外筛选是通过在药物治疗等选择性压力下培养肿瘤细胞来进行的。
c. 体内筛选将转染的细胞群原位或皮下移植到免疫缺陷小鼠体内。
d. 患者来源异种移植(PDX)是通过将患者的肿瘤移植到免疫缺陷小鼠中来实现的。收集PDX肿瘤,体外培养并进行基因改造,以评估肿瘤生长和对治疗的反应。

四、CRISPR/Cas9载体

为了充分利用CRISPR/Cas9的基因编辑潜力,必须使用适当的载体将它们有效地引入靶细胞或组织中。

病毒载体:腺相关病毒(AAV)、慢病毒和腺病毒在基因组编辑治疗中起着至关重要的作用,并已广泛应用于临床前模型和临床试验(表2)。

表2 CRISPR/Cas9系统传递的病毒载体

安全性问题仍然是病毒基因递送广泛临床应用的主要瓶颈,其缺点包括插入诱变免疫应答宽向性。作为替代方案,非病毒载体因其低免疫原性高生物相容性出色的递送大规模生产的低成本而被探索用于癌症治疗。

非病毒载体:基于纳米技术的药物递送系统将进一步拓宽CRISPR/Cas9疗法的应用并提高安全性,为克服病毒载体面临的挑战提供可行的方法(表3)。

表3 基于纳米技术的CRISPR/Cas9传递系统

五、CRISPR癌症治疗的临床应用

过继免疫治疗(ACT)是一种利用免疫细胞,尤其是T细胞来对抗肿瘤细胞的免疫治疗方法。肿瘤浸润淋巴细胞治疗是最早的ACT综合疗法之一(图5a)。然而,ACT受到许多实际限制,包括难以从晚期癌症患者和婴儿中分离出足够的合格T细胞。目前正在研究两种主要的ACT方法:嵌合抗原受体(CAR)-T细胞疗法和转基因T细胞受体(TCR)-T细胞疗法。在大多数情况下,来自患者外周血的自体T细胞在体外分离和激活,然后进行基因工程以表达转基因抗原受体,包括TCR或CAR。随后,修饰的T细胞在体外扩增,然后输回患者体内(图5b)另外,还可从健康供体中分离原代T细胞并进行纯化,CRISPR系统用于引入CAR和编辑TCR。编码内源性TCR和人类白细胞抗原(HLA)的基因随后被CRISPR/Cas9敲除,以产生“通用”同种异体CAR-T细胞或TCR-T细胞(图5c)。

图5 过继细胞治疗(ACT)的三种主要方法以及CRISPR在其中的应用 

嵌合抗原受体(CAR)是一种重组抗原受体,可以改变T淋巴细胞的特异性和功能,从而产生强大的抗肿瘤反应。经过几代改良,CAR-T细胞被设计成含有多种共刺激信号,促进T细胞持续增殖和抗凋亡,从而诱导强烈和持续的抗肿瘤反应。利用CRISPR系统将CAR定向到TRAC位点,可以避免CAR信号的紧张性转导,并在细胞暴露于抗原后建立有效的CAR内化和再表达,有效延缓效应T细胞的分化和衰竭。尽管破坏CAR-T细胞的内源性TCR的表达并不能显著增加CAR-T细胞的杀伤能力,但这一措施确实能将自体反应和异基因反应的风险最小化(图6)。

图6 CARs的结构和CRISPR/Cas9在CAR-T细胞治疗中的应用 

a. 第一代至第三代CAR的结构。
b. 敲除内源性TCR位点、免疫检查点蛋白和主要组织相容性复合物I类分子可产生通用CAR-T细胞,以增强T细胞杀伤力并避免移植物抗宿主病(GVHD)


临床试验表明CAR-T细胞疗法在实体瘤中效果有限,主要原因是缺乏肿瘤特异性抗原、肿瘤异质性和抑制性免疫TME。CAR只能识别细胞表面抗原,而T细胞受体(TCR)可以识别细胞内蛋白,这不仅扩大了T细胞识别肿瘤抗原的范围,也使TCR能够靶向癌症突变基因组。外源性TCR引入T细胞引起的主要问题之一是受体T细胞上已经存在内源性TCR,因为外源性TCR的引入会导致新的活性TCR二聚体的形成。CRISPR/cas9介导敲除T细胞内源性TCR-β,同时进行癌症反应受体转导,显著增加了tgTCR的表达,增强了基因编辑T细胞对靶癌细胞的杀伤作用。与标准TCR转导的T细胞相比,TCR转导和CRISPR修饰的T细胞对抗原的敏感性提高了1000倍(图7)。

图7 混合TCR二聚体的结构及CRISPR/Cas9TCR-T细胞治疗中的应用。外源性TCR的引入可导致新的反应性TCR二聚体的形成。敲除内源性TCR可避免形成混合TCR二聚体并增加转导TCRtgTCR)的表达,增强转基因T细胞对靶癌细胞的杀伤作用。

六、文章总结

最后总结一下这篇文章:

1)本文回顾了两种新一代基因编辑技术:碱基编辑器先导编辑器。虽然碱基编辑在纠正常见的致病SNP方面特别有效,但先导编辑在纠正致病突变方面提供了广泛的适用性。在不久的将来,CRISPR技术可能成为人类克服遗传疾病的重要治疗方法。

2)开发安全有效的体内载体仍然是CRISPR/Cas9在人类治疗中广泛临床应用的最大挑战。目前大多数临床研究使用病毒载体,但仍需要克服免疫原性细胞毒性致癌性等挑战。纳米技术的快速发展促进了载体聚合物脂质的潜力。

3)虽然仍处于起步阶段,但CRISPR筛选在发现重要的癌症基因和治疗靶点方面提供了巨大的希望。以前的研究使用CRISPR筛选来揭示免疫细胞的功能以及与癌细胞相互作用的机制。而未来的研究将集中在其他免疫调节细胞上,以发现肿瘤微环境(TME)中的新调节途径。

4除了在免疫肿瘤学上取得一些突破外,人原代T细胞的CRISPR基因编辑可以产生抗肿瘤活性更高、不良反应更低的同种异体T细胞,这使得通用CAR-T细胞在临床上得到广泛应用成为可能。精确的基因编辑有望改善急性白血病患者的预后,显著降低制造成本,并克服与ACT相关的脱靶效应移植物抗宿主病(GVHD)

总而言之,这篇综述是一篇对CRISPR技术有着很好归纳性的文章,也为CRISPR的临床应用指明了方向。




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