人类食管癌肿瘤微环境细胞亚群细分

人类食管癌肿瘤微环境细胞亚群细分 by 单细胞天地

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文章信息

英文标题：Dissecting esophageal squamous-cell carcinoma ecosystem by single-cell transcriptomic analysis
期刊：Nat Commun
发表时间: 2021-12
DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-021-25539-x
GEO数据库编号：GSE160269

文献概述

问题：ESCC肿瘤的细胞组成以及细胞类型还有癌细胞和免疫类型细胞的相互作用。

结果：文章研究了128个体的单细胞转录组的ESCC肿瘤的组成。从恶性上皮细胞中确定了8个常见的表达程序并进行定义，并分析了癌细胞与其他细胞之间的相互作用以及TME中不同细胞类型之间的相互作用。还确定了一些与患者生存显著相关的几种标志物，这可能与ESCC患者的预后有关。

结论:基于大量单细胞RNA-seq数据描绘出ESCC肿瘤组织及其TME中癌性上皮细胞，基质细胞和各种浸润免疫细胞之间的交互网络的全面图谱。还将癌症上皮细胞中的转录组变化与其体细胞基因组突变联系并确定了与患者生存相关的几个重要标志物。

实验结果

ESCC肿瘤组织的scRNA-seq分析

文章中对于数据的过滤指标：去除了在所有细胞中检测到表达的<0.1%的基因，并过滤掉了基因计数<500和线粒体RNA >20%的细胞。

文章选择了60例ESCC肿瘤和4例相邻正常组织样本进行了scRNA-seq和T细胞受体TCR-seq。CD45- 细胞中鉴定了8个主要细胞群：上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、周细胞和成纤维网状细胞，在 CD45+ 细胞中鉴定了 T 细胞、B 细胞和髓系细胞。

通过从转录组数据集和全基因组测序（WGS）结果推断的拷贝数变异（CNV）所证明上皮细胞亚群的高基因组不稳定性，表明大多数上皮细胞是恶性的。然后，文章系统地分析了每个ESCC的生态系统组成，发现患者内部和患者之间的细胞类型比例变化很大，一些变化与组织类型和肿瘤分期有关表明ESCC肿瘤微环境具有高度异质性。

上皮细胞亚群肿瘤内和肿瘤间异质性之间的相关性

作者将不同患者的上皮细胞重新聚类分成38个亚群，并分析每个亚群在不同患者的比例，发现其中24个细胞亚群（≥75%）来自单个患者，而其他14个亚群则由多个患者构成。作者将上述24个亚群定义为第一组亚群，另外14个亚群定义为第二组亚群。同时第一组中多与细胞增殖和EMT的途径活性等方面有关，而第二组与免疫相关途径的激活，如补体，炎症和IL2/STAT5信号传导等有关。

通过比较上皮亚群组成，发现21名患者的ESCC主要由第一组亚群组成（≥60%），来自31名患者的ESCC由多个第二组亚群组成。这些结果表明ESCC中普遍存在肿瘤内和肿瘤间的异质性。在综合量化后肿瘤内和肿瘤间的异质性水平，发现两者是正相关。同时在具有相同肿瘤内异质性水平的患者中，具有第一组亚群的患者具有相对较高的肿瘤间异质性水平高于未具有第一组簇的患者。

上皮细胞8种常见表达程序的鉴定

文章对于上皮细胞重新分群基于每个亚群的 top30 基因进行层次聚类，划分出8个不同功能和细胞状态的表达程序。

黏膜免疫样（Mucosal）程序的特征在于表达与先天免疫应答（例如S100P）和粘膜防御机制相关的基因，包括粘膜趋化因子（例如CXCL17）和粘液产生（例如AGR2和MUC20）。

应激反应（Stress）程序由即时早期基因（例如EGR1，JUN和FOS）组成，这些基因响应广泛的细胞刺激而被激活。

抗原呈递（AP）程序增加了参与启动适应性抗肿瘤免疫应答的主要组织相容性复合体（MHC）II类分子的表达。免疫相关途径，如同种异体移植排斥反应、IFN-γ、IFN-α反应和补体途径，在AP细胞中被激活，可能表明对肿瘤新抗原的反应性。

细胞周期程序的特征是参与细胞增殖的基因（例如CENPW，CKS1B和BIRC5）的高表达，并呈现E2F靶点，G2M检查点和MYC靶点通路的激活，表明肿瘤细胞增殖。

两个程序与上皮分化有关（Epi1/2）。Epi1程序的特征在于应激角蛋白（KRT6，KRT16和KRT17）的表达，这些角蛋白与角质形成细胞过度增殖有关，因此可能促进肿瘤产生和肿瘤发育。

Epi2程序具有与末端分化相关的过表达基因，如包膜蛋白（SPRR1A/1B）和钙卫蛋白（S100A8/9）、顶端表面、PI3K/AKT/mTOR信号传导、补体和p53通路。间充质细胞样特性（Mes）程序由VIM和SPARC等基因组成，并显示出上皮-间充质转化（EMT）和血管生成途径的激活。

氧化应激或解毒（Oxd）程序的特征在于表达参与防御氧化损伤的多种过氧化物酶和还原酶（例如，GPX2和AKR1C1）。

通过相关性分析不同表达程序之间的相互作用，确定了5组显著的共相关程序，并对8个表达程序进行比例打分以及对患者进行聚类，发现每个表达程序在 ESCC 患者之间不同，大多数 ESCC 患者表达不止一个程序。这些结果表明肿瘤中的上皮细胞8个表达程序表达活性在肿瘤之间具有高度异质性。

ESCC肿瘤微环境的免疫抑制性作用

文章重新分群T细胞鉴定9种不同的T细胞和NK细胞。T细胞亚型包括幼稚T 细胞， TH17细胞，滤泡辅助T（TFH1/2）细胞，调节性T细胞，记忆T细胞，效应T细胞和耗竭T细胞。在ESCC肿瘤中富含调节T细胞和耗竭T细胞，缺少初始、效应和记忆 T 细胞，表明 TME 处于免疫抑制状态。与 I 期肿瘤相比，II/III 期 ESCC 的耗竭 T 细胞和 Treg 评分显著升高，说明 ESCC 的 TME 免疫抑制状态随着肿瘤进展而恶化。

根据scTCR分析ESCC中T细胞的谱系结构，发现TCR克隆型和增殖型比例在不同T细胞亚型中高度多样化。最主要的耗竭 T 细胞在整个ESCC进展过程中在免疫抑制TME中高度增殖并产生作用。

文章还分析了ESCC肿瘤和邻近正常组织中的B细胞，并区分出5种亚型，分别指定为静息B细胞，活化B细胞，生发B细胞（GC B1/B2）和浆细胞。生发 B细胞中TOP2A等增殖基因的高表达表明这些细胞在增殖中具有活性。生发 B细胞、FRCs 和滤泡辅助T细胞的存在表明存在三级淋巴结构（TLS），该结构在其他免疫抑制TME中起抗肿瘤作用。

由于肿瘤浸润髓系细胞（TIM）已被证明是调节先天性和适应性免疫反应以及促进肿瘤血管生成，侵袭和转移的基础。文章对髓系细胞重新聚类定义11个亚型，包括4种：单核细胞（Mono01-03），肿瘤相关巨噬细胞（TAM01-04），肥大细胞（Mast）和树突状细胞（DC）。并确定DC细胞的重要性，

DC有三种不同的亚型，具有不同的作用：常规DC（cDC），耐受性DC（tDC）和浆细胞样DC（pDC）。成熟的cDC具有高表达的MHC II类分子（例如HLA-DRA），共刺激因子（例如CD80和CD86）和促炎细胞因子（例如TNF和IL1B），可能激活T细胞和其他抗肿瘤免疫。

与成熟的cDC类似，tDC也具有MHC II类分子和共刺激因子的高表达，但促炎细胞因子TNF和IL1B的表达为零，表明这些细胞作为一种半成熟表型。此外，tDC的免疫检查点基因（IDO1，PD-L1和PD-L2）的表达最高。文章还发现ESCC肿瘤富含tDC，与邻近正常组织相比，肿瘤中PD-L1/L2在tDC中的表达显著更高。根据配体-受体相互作用分析表明，在免疫抑制方面，tDC与多种T细胞亚型的相互作用比cDC、pDC或TAM更强。同时文章证明出tDC对CD8+ T细胞增殖和活化的抑制作用很可能是通过PD1和PD-L1相互作用介导的。总的来说，这些结果表明，TIM中的tDC在免疫抑制性ESCC TME中起着至关重要的作用。

成纤维细胞和内皮细胞在肿瘤中的特殊作用

成纤维细胞和周细胞可以通过周细胞-成纤维细胞转化分化为肌成纤维细胞，是TME的两个重要组成部分，可能促进肿瘤侵袭和转移。因此，文章将成纤维细胞和周细胞分出9种亚型，如正常粘膜成纤维细胞（NMF），正常活化成纤维细胞（NAF1/2），癌症相关成纤维细胞（CAF1-4），周细胞和血管平滑肌细胞（VSMC）。NMF表达了一组编码蛋白酶抑制剂（例如SLPI和PI16）的基因。NAF1/2表达伤口愈合反应相关基因（例如IGF1、C7和APOD）。CAF1和CAF2表达促炎趋化因子（例如CXCL1和CXCL6）和其他参与募集免疫细胞的细胞因子，显示出活化的炎症状态。但CAF2细胞表达活化的周细胞特异性细胞因子CXCL5/8等并且炎症反应途径相关基因显著上调。CAF3与CAF4表达的肌成纤维细胞标志性基因（例如TAGLN，ACTA2和ACTG2），但CAF3的表达水平低于CAF4。CAF3和CAF4均对顶端连接和EMT通路有上调。在所有成纤维细胞亚型中，CAF4具有最高的糖酵解和血管生成活性，这是癌症产生的标志现象。

另外作者发现成纤维细胞具有两种不同发育轨迹，在一个分支中发现从 NMF 到 NAF1/2、CAF1、CAF3 和 CAF4 的发育轨迹，另一个分支发现周细胞、CAF2 和 CAF4 的分化轨迹。文章运用（PAGA）分析推断不同亚群之间相互作用，发现 CAF1 与 NAFs 和 CAF4 相连，而 CAF3 则是与 CAF2 和 CAF4 之间的联系更加密切。这些结果表明，正常的成纤维细胞和周细胞都可能分化为肌成纤维细胞。观察比例变化NMF和NAF1在正常组织中比肿瘤组织更高，而CAF2/3/4，VSMC和周细胞在肿瘤组织中占主导地位。此外，II/III期ESCC肿瘤比I期肿瘤具有更多的CAF3和CAF4，但CAF1更少。这些结果表明CAFs，特别是肌成纤维细胞，在ESCC微环境中的积累可能在肿瘤进展中起关键作用。

由于内皮细胞（EC）在TME中经常表现出异常的表型和功能，这可能会限制它们对抗血管生成治疗的反应，因此文章将EC重新分为6种亚群，包括3种正常EC（NEC1-3）和3种肿瘤EC（TEC1-3）。NEC1/2 表达静脉内皮标志物（例如 CPE 和 ACKR1），而 NEC3 表达动脉标志物（例如 SEMA3G 和 GJA5)。TEC具有特异性激活参与细胞增殖，血管生成，TGF-β信号传导，EMT和能量代谢的途径。值得注意的是，TEC与抗原呈递（例如CD74和HLA-DQA1）和细胞粘附（例如ICAM1和VCAM1）相关的基因表达水平低于NEC，但与血管生成相关的分子（例如，VEGFR1/2/3和PDGFB）的表达高于NEC。

由于PDGFB-PDGFRB信号通路在周细胞-肌成纤维细胞转化中起关键作用，PDGFB主要由内皮细胞分泌。基于配体-受体相互作用分析，我们发现TEC和周细胞之间存在很强的相互作用。周细胞与EC的比例与TEC中的PDGFB水平呈正相关，符合PDGFB对周细胞的募集作用。此外，TEC中PDGFB的表达水平与CAF2和 CAF4的比例同样相关。此外，SCENIC 分析表明，MAPK 下游的几种 ETS 家族转录因子（EHF、ELF3 和 ETS2）在 CAF2 中被激活，这些转录因子可由 PDGFB-PDGFRB 途径诱导。这些结果表明，ESCC TME中的TEC可能通过诱导周细胞向肌成纤维细胞的转变来促进肿瘤血管生成，从而促进肿瘤进展。

接下来，文章通过对相关细胞亚型进行聚类来探索免疫和非免疫基质细胞之间的关联，从而区分良性和恶性组。良性组包括NMF、NAF1、CAF1和NEC亚型，恶性组包括CAF2−4、TEC和VSMC。良性组与有效免疫细胞之间存在很强的关联;而恶性组倾向于与抑制性免疫细胞相关。Treg细胞与Tex细胞比例与恶性组细胞比例呈正相关。此外，TH17是产生IL-17的细胞，IL-17是一种与周细胞活化相关的细胞因子，而且与CAF2呈正相关，这与周细胞的发育轨迹一致，提示CAF2可能是活化的周细胞。免疫和非免疫基质细胞之间的这些广泛相互作用可能形成促进肿瘤进展的免疫抑制性ESCC TME。

上皮表达程序和基因组改变与TME组成的关联

文章对于恶性上皮细胞与ESCC TME中与免疫类型细胞之间的相互作用进行探究确定了不同上皮表达程序和不同的基因突变模式具有不同的肿瘤微环境

通过全外显子测序（WES）检测出11个推定的驱动基因在ESCC中发生突变，其中最常突变的基因是TP53（89.1%）和NOTCH1（28.3%）。食管上皮细胞中一些驱动基因的体细胞突变可能驱动上皮表达程序和促进肿瘤进展的TME的改变。由于上皮表达程序可能反映基因组改变信息并驱动ESCC TME组成的重塑。分析上皮表达程序与疾病之间的关联鉴定出14个基因的表达水平与ESCC患者的生存时间显著相关确定黏膜程序中的AGR2、CXCL17和MUC20与患者的生存时间显著相关。AGR2编码肠粘液产生所必需的内质网蛋白，介导基本的先天免疫。CXCL17产生粘膜相关趋化因子，支持先天免疫以及粘膜的稳态和完整性。MUC20编码粘蛋白，该蛋白是不溶性粘液屏障的一部分。并通过Bulk 转录组数据和免疫组织化学染色对这三个基因的进行验证。我们发现，在scRNA-seq数据中，表达AGR2 / CXCL17 / MUC20的上皮细胞比例与粘膜程序有关，表明这三个基因可以共同用于预测粘膜程序活性。GSVA进一步研究黏膜活性高的肿瘤的迁移和促血管生成能力受到抑制，抑癌基因p53相关通路显著富集，解释了高粘膜指数具有更好预后的原因。

结论

文章通过大量数据分析确定食管癌中42个功能亚群，包括26个免疫细胞亚型和16个非免疫基质细胞亚型，详细探究了癌上皮细胞与其他类型细胞之间的相互作用，还剖析了ESCC的细胞组成与基因表达调控两者之间的关系。

推断tDC，耗竭 T 细胞和 Treg可能在免疫抑制方面发挥重要作用。其次，非免疫基质细胞的复杂组成及其在ESCC TME中的动态转变以及TEC中PDGFB的特征性高表达与ESCC TME中周细胞，CAF2和肌成纤维细胞有关，可能表明TEC在重塑TME中起作用。

不同的细胞亚群的相互作用，例如TFH1和GC B细胞之间的相互作用，其通过TLS的形成产生抗肿瘤免疫环境，TEC2和TN细胞之间的相互作用，阻碍免疫细胞向肿瘤组织浸润，以及TH17细胞可能在周细胞-肌成纤维细胞转化中起重要作用。活性癌性上皮细胞表达程序与恶性非免疫细胞或抑制性免疫细胞之间存在广泛的交流。这些结果表明，ESCC TME中的细胞交织在一起以促进肿瘤的存活和发展。

此外，根据单细胞转录组与WES检测到的全外显子突变联系起来。确定NOTCH1与TP53等基因的突变对于肿瘤中各细胞亚群功能的改变有重要作用。

结合Bulk转录组分析发现粘膜免疫样（粘膜）程序中CXCL17，AGR2和MUC20的表达水平与患者的ESCC生存时间显著相关，是ESCC预后存活相关的最佳标志物。

文献阅读感想

该文献使用大量数据进行分析ScRNA-seq , Bulk-seq , WES联合分析将食管癌的各个亚群进行清楚的区分，对细胞与细胞间的交流进行探究，推断出各个亚群所起到的重要作用。

该文章对于上皮细胞的分群采用功能分群并提供了标志性基因，我自己最近也是在看上皮细胞亚群的分群看到了这篇文章，还有在知网上的一篇博士论文：

[1]林霖. 单细胞转录组解析食管癌发生多阶段过程中上皮及基质微环境动态变化[D].北京协和医学院,2022.DOI:10.27648/d.cnki.gzxhu.2022.000006.该论文的作者是对于这篇文章进行了后续的一个补充并且深入研究。

同样我自己对于两篇文章所提供的上皮标志基因进行了一个探究，选择了一个食管鳞状细胞癌有关数据集（GSE188900）进行分群看了一下。

上皮细胞分群的标志基因还是可以确定一些亚群的。

genes_to_check =list(
Stress=c("DUSP1","EGR1","FOSB","FOS","JUN","NFKBIA","ATF3","NFKBIZ","BTG2","ZFP36","NR4A1","CNFN","SPRR"),
AP=c("CD74","HLA-DRA","HLA-DRB1","HLA-DPA1","HLA-DRB5","HLA-DPB1"),
Mucosal=c("AGR2","CEACAM6","FAM3D","CXCL17","PRSS20")
Mes=c("VIM","SPARC","CALD1","TAGLN","FN1","DCN","COL1A1","TPM2","MYL9","MYLK"),
Krt=c("SBSN","CSTB","SERPINB3","SERPINB1","LGALS7","LGALS7B","KRT16",
        "KRT17","KRT6A","KRT6B","KRT6C","FABP5","LY6D","S100A2","S100A10"),
cyc=c("CENPW","CKS1B","TUBA1B","UBE2C","CDKN3","CCNB1","BIRC5"),
Terminal=c("S100A7","S100A8","S100A9","SPRR1A","SPRR1B","SPRR2A","SPRR2D","SPRR3","RHGG"),
Oxd=c("ADH7","CES1","PGD","GSTM2","GSTM3","ALDH1A1","ALDH3A1","AKR1C1","GPX2","AKR1C2","AKR1B10","GSTA1"),
  SMG=c("KRT7","ALDH1A3","MIA" , "RARRES1","KRT23")
)