单细胞图谱细化结直肠癌的分类

单细胞图谱细化结直肠癌的分类 by 单细胞天地

分享是一种态度

前言

文章题目：Refining colorectal cancer classification and clinical stratification through a single-cell atlas
日期：2022-05-11
期刊：Genome Biology
链接：https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-022-02677-z

摘要

结直肠癌 (colorectal cancer, CRC) 是世界上第三大最常见的癌症，大约三分之一的患者在根治性手术切除和化疗后出现复发。目前只有少数治疗被批准治疗少部分特定的CRC患者，例如针对微卫星不稳定 (MSI-H) 肿瘤中的免疫检查点抑制剂以及针对BRAF V600E mutant 的CRCs使用联合 EGFR/BRAF抑制剂。

大量研究表明，间质和免疫细胞，例如成纤维细胞和细胞毒性 T 细胞可能是临床效果的关键驱动因素。肿瘤微环境 (TME) 内异型细胞多样化的相互作用控制着其肿瘤生物学，进而控制着 CRC 的临床表型。

目前基于大规模基因表达数据对CRC进行了分子分型，发布了consensus molecular subtypes (CMS)，并将CRC分为了 CMS1（MSI 免疫）、CMS2（典型）、CMS3（代谢）和 CMS4（间充质）。不过目前基于PD-L1/TGF-ß expression signatures对患者进行分型筛选（尤其是针对CMS4亚型的筛选）由于无效被终止，这意味着 CMS 不能完全反映结直肠癌的生物学多样性。因此，应该将CMS作为进一步研究的基础，发掘新的生物标志物。

作者试图了解肿瘤上皮细胞、间质细胞和免疫细胞的细胞群如何塑造 CRC图谱，发现了影响每个 CMS 组中免疫和基质细胞浸润的肿瘤细胞的独特内在特征。

单细胞聚类分群

作者拿到了16个不同种族、未接受过治疗的CRC患者组织和7个癌旁正常结肠组织样本进行scRNA-seq，得到了49589个细胞，聚类分群得到：

epithelial cells (EPCAM+, KRT8+, and KRT18+), fibroblasts (COL1A1+), endothelial cells (CLDN5+), T cells (CD3D+), B cells (CD79A+), and myeloid cells (LYZ+) based on canonical marker genes

之后为了解析每种分子亚型的肿瘤及微环境的组成，作者又进行了细分，得到了49个亚群，包括了免疫、基质和肿瘤细胞。肿瘤细胞的分布主要根据不同的患者，也证明了患者间存在的异质性。另一方面，基质和免疫细胞则按照不同的细胞类型各自聚集，患者的来源对它们的分布影响不大，表明几乎没有批次效应。

肿瘤上皮细胞的不同CMS组之间的异质性

目前不清楚癌细胞的内在机制是否会对不同CMS组的基质和免疫浸润产生影响，作者又拿到了其他已发表的数据集和自己的组合起来，总共得到38 samples (N = 7,530 tumor cells），之后再分成不同的CMS亚型。经过批次校正和归一化后，作者进行了差异分析和富集分析。

发现不同CMS组之间存在明显的肿瘤细胞转录层面差异：

CMS1 肿瘤上皮细胞主要富集在免疫、蛋白酶体、JAK-STAT 和 PD-1 信号通路
CMS4 肿瘤上皮细胞主要富集在上皮-间质转化 (EMT)、VEGF 和 TGF-β 激活等通路
CMS3 和 CMS4 肿瘤上皮细胞富集到了 Wnt 通路，而Wnt活性从结肠隐窝区域的基部到其他分化区域呈现递减，表明CMS亚型与结肠隐窝的位置有关
CMS2 肿瘤上皮细胞高表达了因MYC 和 DNA 修复基因拷贝数改变而驱动的基因；此外，CMS2 与调节代谢和细胞周期的多种途径相关，证实CMS2是各种 CMS 亚组中异质性最强的

在肿瘤上皮细胞内，多个关键通路如血管生成、炎症、WNT 通路激活在 CMS 亚组之间均存在，作者假设这可能是由于肿瘤内细胞分化产生的瘤内异质性。于是使用了Monocle 2 和 Slingshot分别进行验证。发现异质性与 CMS 分型没有相关性，瘤内 CMS 异质性在 CRC 肿瘤中普遍存在。这个结果和前人研究矛盾，他们认为肿瘤上皮细胞是沿着CMS亚型呈轨迹排列的。于是作者重新对他们的数据进行分析，剔除掉低质量细胞以后发现，依然是没有沿着CMS亚型呈轨迹排列的结论。

肿瘤微环境中CAF 的不同表型

目前研究已经确定了 CRC 微环境中癌症相关成纤维细胞 (CAF) 的相互作用，但没有研究过单细胞水平上CAF异质性和CMS之间的关系。作者对fibroblasts重新分群后得到：adhesion/wound healing/CAF-S1, perivascular/CAF-S4 subtype

CAF-S1s表达了成纤维细胞的特有marker基因：FAP, PDPN, PDGFRA；它可以继续细分为：

(a) myo-fibroblastic (myCAF) (enhanced expression of collagen-related genes (COL1A1 and COL1A2) and fibroblast markers (FAP, PDPN)
(b) inflammatory (iCAF) subtypes (express chemokines such as CXCL12)

之前关于乳腺癌 (BC) 的研究发现CAF-S1 可以进一步细分为至少五个亚型。为了探索CRC 中是否存在这五种亚型中的任何一种，作者来自 BC 队列的 18,296 个 CAF-S1 细胞和 4685 个 CRC CAF-S1 细胞，然后将 CRC CAF-S1 细胞与 BC 队列中的细胞进行了比较。通过比较 BC 和 CRC 之间的差异表达基因，确定了 CRC 患者的所有五种不同的 CAF-S1 亚型：ecm-myCAF（GJB；ANTXR1和SDC1）、wound-myCAF（SEMA3C；ANTXR1和CD9）、TGF ß -myCAF（CST1；TGFß1；ANTXR1和LAMP5）、IL-iCAF（SCARA5；DLK1）和 detox-iCAF（ADH1B；GPC3）

CRC的骨髓细胞亚群

作者将骨髓细胞继续进行分群，得到 CD1C+ 树突细胞、肿瘤相关巨噬细胞（C1Q+ TAM、MRC1+）、单核细胞（S100A8+）和粒细胞亚群。单核细胞表现促炎特征（1L1B、S100A8、S100A9），而 TAM 表现抗炎（APOE、SEPP1、CD163）特征。

C1Q+ 肿瘤相关巨噬细胞不仅在 CMS1 中富集，而且在 CMS4 中富集，在CMS2 和 CMS3 亚型之间没有差异。据报道，C1Q+ TAM 会影响肿瘤中的 CD8+ T 细胞富集，而 TAM 中的 Mettl14 或 Ythdf2 缺陷会通过减少细胞毒性 T 细胞浸润和促进有缺陷的 CD8+ T 细胞积累来阻碍肿瘤缓慢发展。有趣的是，与 CMS1 相比，CMS4 中的 CD8+ 的特征基因表达量更低。总之，作者发现 C1Q+ 肿瘤相关巨噬细胞在 CMS1 和 CMS4 中富集，CD8 T细胞效应子在 CMS4 中减少，很可能与 Ythdf2 缺陷有关。如果在表现出这些特征的 CRC 肿瘤中靶向 C1Q+ TAM 可能会增强免疫疗法，并可能改善患者的预后。

CAF 和 TAM 调节 CRC 中的免疫抑制

作者使用cellphoneDB发现CAF 和 C1q+ TAM 的相互作用会影响T 细胞功能障碍和M2（另类活化巨噬细胞）的极化。这些配体/受体介导的作用主要涉及免疫检查点（CD40LG:CD40、TIGIT:NECTIN2、CD74:COPA、CD28:CD86、SIRPA:CD47 和 CD86:CTLA4）

TAM-T 细胞的 TIGIT-NECTIN2 相互作用与肝细胞癌的免疫抑制有关
CD44-SPP1 信号可以增加神经胶质瘤患者抵抗力，并且与巨噬细胞浸润增加以及生存期较差有关

接下来，作者研究了不同的基质亚型如何与 TAM 和 CD8+ T 细胞相互作用。发现TIGIT-NECTIN2 信号在 CAFS1 亚型和 CD8+ T 细胞之间共享，但 T 细胞配体-受体抑制信号 (LGASL9-HAVCR2) 特定于 ecm-myCAF。CAF-S1 和 TAM 相互作用由 CAF-S1 表达的 C3 和 CSF1 分子以及 TAM 受体 C3AR1、CXCR4 和 SIRPA 介导。值得注意的是，MIF-CD74介导的 CAF-TAM 相互作用增加了 CAF 中的 CD44 结合，导致 ERK1/2 激活，从而促进增殖并抑制细胞凋亡。之前研究表明，在黑色素瘤中，MIF-CD74的相互作用会导致髓源性抑制细胞介导的免疫抑制。此外，作者发现 ecm myCAFs 可以通过 TGFB1-TGFBR1/2 与 TAM 相互作用，这已被证明促进癌症进展。