探究钙调素结合蛋白IQCF5作为细胞自我更新/分化状态的感知分子的可能性

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探究钙调素结合蛋白IQCF5作为细胞自我更新/分化状态的感知分子的可能性 by 东林的扯淡小屋

摘要：目的通过研究生殖细胞谱系的发育，找到特定的trigger基因实现细胞命运的转换。方法通过已有文献对原始生殖细胞的转录组和DNA甲基化组的生物信息学分析，选择可能的作用因子，能够在细胞自我更新和分化的动态平衡中起到支点的作用，即能够显著影响这个动态平衡，使细胞更加偏向于自我更新或者分化。然后通过基因敲除或者过表达等方法进行生物学验证。结果发现分化谱系轨迹：精原干细胞到初级和次级精母细胞的分化，到最终的精子，具有不同的分子特征。通过进行生物信息学分析选择特定的分子如钙调素结合蛋白IQCF5，可能在干细胞的维持或者分化中起到重要作用。利用CRISPR技术敲除基因并进行分子，细胞，动物行为学实验的表征，最终探究其可能的分子机制。结论我们认为这种特定的分子，钙调素结合蛋白IQCF5，能够沟通不同的细胞状态，能够对这个分子的简单处理（促进/抑制表达）实现细胞命运的改变。

 

一、立论依据（国内外研究现状分析，提出科学问题）

原始生殖细胞起源于外胚层附近。经过最初的有丝分裂增殖分裂，在人类妊娠4-5周或者啮齿动物妊娠11-13天时，原始生殖细胞迁移到发育中的性腺中，组成睾丸或者卵巢[1]。出生后，原始生殖细胞进入有丝分裂静止时期，称为生殖细胞。其中，雄性生殖细胞在出生后不久恢复有丝分裂的能力，并迁移至生精小管的基膜，在那里它们形成精原干细胞，随后终身保持干性[2]。精原干细胞（SSCs）是出生后男性生殖细胞的干细胞，不仅能够自我更新，持续产生分化后代，也可以通过分化实现细胞命运的转换，可以分化为精母细胞（初级和次级，进行减数分裂），最终产生精子。这个过程有Waddington's Landscape的变化，即一系列的表观遗传学修饰[3]，包括DNA甲基化、组蛋白乙酰化等等，对应于细胞分化潜能的不断下降：位于顶层的干细胞可以分化为成熟的细胞，但成熟的细胞变回原来的干细胞是很难发生的，如同从高楼扔下一个球很容易，但把已经扔下来的球扔回原来的高楼就很困难了。关于这个Waddinton的发育景观假说，我们觉得能够对应于自然界的能量分布。我们把干细胞这种具有多分化潜能的细胞视为一种高能的状态，而已分化的成熟细胞就是一种低能状态。而我们自然界一向都是能量越低，越稳定，所以干细胞总是倾向于分化。要维持干性，需要耗费更多的资源，如同需要建筑大坝才能将水库的水维持在一定水平。山中伸弥发现这个过程是可逆的[7]，将成纤维细胞逆分化为多能干细胞，但这个过程很复杂，可以视为耗费大量能量来维持细胞的高能状态。根据物理学的观点，机体是一个耗散系统，能够从外界摄取负熵，从而维持系统内部的稳态，比如说维持干细胞的自我更新。但这种能力是有限的，所以干细胞还是不可避免地减少，对应于机体的衰老，各种机能的下降。

通过研究不同发育阶段原始生殖细胞（PGC）的转录组和DNA甲基化组，发现了人类原始生殖细胞与小鼠原始生殖细胞的关键分子特征[4,5]，从而可能寻找到特定的分子，能够实现不同细胞命运之间的转换。如同醛缩酶具有对葡萄糖的感知能力，能够实现细胞饥饿和饱状态的转换，从而调节能量代谢[6]。我们可以在这个基础上找到的特定基因，可能实现细胞命运之间的转换，如同山中伸弥往成纤维细胞通过慢病毒转入四个转录因子（Oct4, Sox2, Klf4 和c-Myc）从而能够逆分化为多能干细胞[7]。

我们是否可以通过这些可能影响精原干细胞的基因的处理，来实现我们期望的对生殖发育过程的精确调控？并且是否存在特定的分子，能够感知干细胞自我更新和分化趋势，如同杠杆的支点，我们能够在这个基础上找到特定的蛋白质，同时调节自我更新和分化，使得细胞整体发生可控的改变？比如说我们敲除该基因可能导致生殖发育紊乱，当我们过表达该基因的时候，能够促进细胞的自我更新；抑制该基因表达的时候，能够促进细胞的分化。

根据郭国骥发表的小鼠细胞图谱数据[10]，我们通过生物信息学分析筛选到一群可能起到这种特定功能的分子。

因此我们提出假设，细胞的能量状态是影响细胞维持自我更新还是分化的重要机制，其中钙调素结合蛋白IQCF5可能作为细胞能量状态的感知分子，从而能够调节细胞自我更新/分化状态。

二、设计思路（提出解决科学问题的思路，阐述实验设计的目的、意义或应用前景）

使用组学技术来挖掘底层的生物学模式，揭示动态的信号通路和代谢变化，从而来理解精原干细胞发育的机制。这是数据驱动的生物学发现，通过组学技术得到的大规模数据来进行一定的分析，更大的分子标记得到更加精细化的细胞分类，从而提取出这些特征能够用于各种通路的发现，制定一定的细胞分期，最后来理解各种生物机制[8]。生物信息学分析发现Stem cell signalingfactors和Stemcell transcription factors表达持续下降，Mitochondria & Diff.transcription factors Diff. signaling factors & RNA splicing和Cell cycle表达持续上升，因此关键的多能性因子(NANOG, POU5F1)和辅助性的因子(KLF4, SALL4)），可能能够对细胞重编程机制有一定的解释作用。

DNA甲基转移酶的水平在新生儿和出生后的雄性生殖细胞中有一定的动态变化[5]，说明基因组的表观遗传学修饰如DNA甲基化在干细胞形成和分化过程中起到重要的作用。全局CG甲基化水平在出生后的雄性生殖细胞中稳定，成体精原干细胞中甲基化的差异很小，说明出生后的表观遗传学修饰如DNA甲基化变化不大，对基因表达的调控作用有限。但鉴定在干细胞功能和精子发生的重要基因内部和周围的许多区域，具有阶段特异性差异甲基化，即说明在时间尺度还是存在DNA甲基化的变化的，可能发现特定基因表达能够发挥相似的功能，通过找到特定区域的甲基化位点，这些区域包含特定转录因子的结合位点，包括SOX家族成员。我们找到所鉴定的基序与SOX家族成员如SOX10和SOX3的结合基序高度相似，说明可能通过甲基化这些转录因子来起到基因表达模式的调控作用：cluster-1 DMR相关的基因：转录因子NFATC1（细胞因子诱导），RFX4（反式激活）和TCF3（也称为E2A）（形态发生）。cluster-2 DMR相关的基因：IRF3（干扰素应答），CEBPB（CEBPB / AP1复合物;免疫应答），EGR2（细胞增殖，神经发育），SOX2（多能性）和TFAP4（细胞增殖，分化阻断）。cluster-1和-2 DMR相关基因：Stra8，Plzf，Smoc2或Ski。cluster-3 DMR相关的基因：Col22a1，Gfra1（SSC维持必需的GDNF受体组分）和Pcp4I1。

因此，在生殖细胞的发育过程中，可能通过DNA甲基化来影响与细胞能量状态相关的分子的表达水平，从而调控干细胞的自我更新和分化相关的分子机制，并最终导致细胞表型的变化。

最后，我们通过郭国骥课题组发表的小鼠细胞图谱[10]来验证我们的发现，这个tSNE图距离相近的cluster能够表示这个精子分化的轨迹（精原干细胞到初级和次级精母细胞的分化，以及最后的精子细胞），通过已有的分子标记来寻找哪些基因会影响到干细胞分化到精子的功能。

（http://bis.zju.edu.cn/MCA/gallery.html?tissue=Testis）

目的：通过生物信息学分析和生物学验证，找到这个理论上具有感知能量状态改变和调控细胞自我更新/分化的分子，为我们后续开发药物提供很好的靶点，对流产、胚胎停育、不孕不育等疾病可能有一定的疗效。我们认为这种特定的分子，能够沟通不同的细胞状态，能够对这个分子的简单处理实现细胞状态的改变。如增强抑癌基因相关的信号通路，抑制癌基因的信号通路，使得最后的平衡往抑癌基因的功能移动，从而实现对癌症的预防，以及治疗。

意义：已有研究实现体外诱导胚胎干细胞产生单倍体样精细胞[9]，具体路径：ESC在bFGF/ActivinA的诱导下变成EpiLC，然后在BMP4/BMP8a/SCF/EGF/LIF混合物中培养生成PGCLC。然后与无精症小鼠的睾丸体细胞共培养，在视黄酸/BMPa/Activin A的影响下进行减数分裂生成精细胞样细胞。这个过程比较复杂繁琐，因此我们的发现可能有助于分化体系的优化和简化。

三、实验内容

1生物信息学研究，通过组学的数据发现与胚胎发育相关的基因：

通过对已有文献的调研，找到一些影响干细胞自我更新或者分化的基因。我们假设能量代谢相关的基因可以在这个过程中起到关键作用。

我们对郭国骥的细胞图谱（http://bis.zju.edu.cn/MCA/gallery.html?tissue=Testis）进行筛选睾丸中不同类型细胞的差异表达基因，这项工作已经完成，我们已经拷贝下来用于进一步的分析。利用相关的生物信息学分析软件进行分析，我们使用一站式的功能注释软件funrich（http://www.funrich.org/）。

2生物学验证，通过一系列的实验来验证该基因在特定疾病发挥的作用：

通过CRISPR技术来敲除基因，分别建立敲除的精子和卵子，然后通过显微注射（辅助生殖的技术）来形成受精卵，观察其早期发育过程，并且可以观察到一系列的表型变化，包括marker蛋白质的表达，HE染色切片观察其结构的变化，小鼠行为学变化。

3具体的分子机制研究：

表观遗传学机制：我们可以探究是否通过对甲基转移酶的调控，从而影响特定基因DNA序列的甲基化来影响基因表达。

基因表达调控机制：我们期望找到这种关系：AA基因通过YY信号通路抑制/促进BB疾病的CC生物过程如自我更新/增殖/分化。通过相关研究提出假设，即具体的调控机制。然后去实验证明或者证伪：对特定调控分子分别进行抑制，过表达以及拯救实验来探究是否这个假设在特定表型中发挥一定的作用。

该基因具体功能的研究，可以参考实验室已经发表过的一篇文章[11]，利用CRISPR技术来敲除特定基因，并且进行一系列的表征：蛋白质层次，细胞层次，组织层次以及动物行为学层次。

要通过各种实验手段找到表达具体相关性的分子通路，如各种细胞分化相关的分子标记物，然后在细胞层次的变化。

首先可以抑制/过表达特定机制，观察表型如生物过程是否有变化。然后选择新的个体来过表达该机制，观察表型变化，然后通过拯救实验来回复原有表型，说明该机制能够发挥作用。

四、实验方案（包括实验材料、方法、技术路线等）

细胞培养：一般的细胞培养是细胞+培养液（血清+细胞因子）+CO2+温度，模拟机体的环境来促进体外细胞生长。需要不断摸索条件来实现最佳效果。细胞培养和传代，批量生产用于持续做实验。质量控制，如台盼蓝染色看细胞活性之后做进一步的实验。

提取DNA：细胞裂解（SDS和蛋白酶K）,56℃水浴过夜（至少3小时），然后4℃保存。加氯仿变性（避光）。离心（12000g,15min）。取上相（上相是水和DNA,中间是蛋白质和RNA，下相是氯仿和水）。加等体积的异丙醇，然后混匀后离心。吸上清，加70％乙醇1mL，离心后弃上清，离心2min晾干。等沉淀变透明加20μL水溶解。最后测浓度，调整浓度去做PCR。

qPCR：PCR体系包括引物，ddNTP，模板（样本DNA），热稳定聚合酶taq酶等等。现在有试剂盒，于是具体的体系是模板：引物：水：mix=2:3:15:20μL。引物设计，使用prelprimer软件。在pebmed搜索基因和转录本，选择能够转录更多转录本的引物，能够更加靠近共同的外显子，一般比较靠近3'端。考虑很多情况，如多个转录本，可变剪切。可能有各种错误，比如说表达其他的转录本但引物设计不合理从而不能检测到。

Western blot蛋白免疫印迹：制胶：浓缩胶和分离胶。浓缩胶起到均一化的作用，使得不同分子质量的蛋白质在浓缩胶最后能够在同一起跑线开始进行分离。电泳。加一抗，将分离的蛋白质和特定的抗体结合，形成新的蛋白质复合物。转膜。加二抗，更加特异性地展示蛋白质的表达水平。显色：加荧光染料如辣根过氧化酶。

统计分析：使用SPSS进行统计分析，使用two-tailed Student’st-test 比较不同组间的差异。p<0.05 为统计显著性的标准。

五、可行性分析

1通过文献调研，找到相关的关键分子。并且根据已有文献，通过假设存在这种具有特定功能的分子，即能量代谢相关的分子，能够沟通不同的细胞状态，允许我们对这个分子的简单处理实现细胞状态的改变，如促进或者抑制分化。

2实验室已经实现体外诱导胚胎干细胞产生单倍体样精细胞的分化体系[9]、关于基因敲除，有利用CRISPR技术敲除能量代谢相关分子的成功经验[11]，并且用于探究早期胚胎发育。我们可以充分利用实验室的平台。

3各种实验技术向老师，师兄师姐请教，尽量减少人为的误差。

六、创新性分析

1查阅最新的文献如细胞图谱，做好文献调研工作。

2运用生物信息学分析手段，如单细胞组学的降维算法来划分细胞类型，从而找到可能在特定生物过程起到关键作用的基因。

3已有研究发现能量代谢与胚胎发育，生殖细胞增殖分化相关[11]，且已有研究发现特定分子醛缩酶对细胞能量状态的感应，从而调节能量代谢[6]。

因此本文提出大胆的设想，假设存在特定的分子，能够感应细胞所处的自我更新/分化状态，能够对这个分子的简单处理实现细胞状态的改变，起到四两拨千斤的作用。

七、预期实验结果

Figure1：细胞图谱。分化谱系轨迹：精原干细胞到初级和次级精母细胞的分化，到最终的精子，能够验证我们选择的分子在不同类型的细胞是差异表达的，因此也可能起到重要作用。

 

Figure2：生物信息学分析。通过文献调研找到相关的基因，并且进行富集分析等等生物信息学分析。

通过寻找精原细胞与精母细胞，精母细胞与精子细胞的差异表达基因，然后找到这分化过程都存在的差异表达基因，即其三种细胞的交集。

找到这些在三种细胞都表达的分子标记物：

1700019D03RIK

TTC23L

1700003P14RIK

SELENOK

MS4A5

1700018C11RIK

NUPR1L

SYCE2

1700034O15RIK

IZUMO3

PHYHIPL

BB014433

IQCF5

FAM122C

TEX30

其中只有九个共同表达的差异基因有注释。进行功能注释：

进行富集分析：发现有减数分裂meiosis和减数分裂联会meiotic synapsis

 

Figure3：寻找细胞状态转换的支点。

根据在GO数据库的结果（http://pantherdb.org/tools/gxIdsList.do?list=upload_1&organism=Homo%20sapiens）

我们选择IQCF5，一种钙调素结合蛋白质可能和能量代谢有关，并且对减数分裂和受体识别起到重要的辅助作用，因此能够感知干细胞内部自我更新和分化两个大趋势，就像一个开关，从而能够对这个分子进行过表达或者抑制来调控细胞自我更新或者分化。但同时其余的分子也可能作为候选分子。

 

Figure4：利用CRISPR技术来敲除特定基因，并且进行一系列的表征。

 

Figure5：分子机制的调控

首先可以抑制特定机制，观察表现是否有变化。然后选择新的个体来过表达该机制，观察表型变化，然后通过拯救实验来回复原有表型，说明该机制能够发挥作用。

八、参考文献

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[2] Cooke P S, Simon L, Nanjappa MK, et al. Plasticity of spermatogonial stem cells[J]. Asian journal ofandrology, 2015, 17(3): 355.

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