8+bulk结合单细胞公共数据库挖掘纯生信

8+bulk结合单细胞公共数据库挖掘纯生信 by 生信人

今天小编给大家介绍的是今年5月发表在Journal of Translational Medicine(IF:8.440)上的一篇纯生信公共数据库挖掘的文章，本文综合了bulk RNA-seq、scRNA-seq和空间转录组数据揭示了在膀胱癌(BCs)中浆细胞(PCs)如何与肿瘤细胞交流，以及BCs患者对免疫检查点抑制剂(ICIs)的反应和临床结果的影响。

背景

膀胱癌(BCs)具有固有的侵袭性，易复发的特性，患者通常需要多模式、有创性的治疗，但其无复发生存率较低。免疫检查点抑制剂(ICI)相比其他治疗方法具有更好的安全性和更持久的反应，对进一步改善患者的临床管理和预后具有重要意义。肿瘤相关的三级淋巴结构(TLSs)最近被发现，并与BC患者更好的生存和免疫反应相关，TLSs中不仅含有大量的T细胞，还含有大量的ICI反应性B细胞，浆细胞(PCs)是TLSs中关键的B细胞群，肿瘤相关的巨噬细胞、成纤维细胞和中性粒细胞已被报道与B细胞相互作用并介导其向PC的分化。然而，目前尚不清楚PC是否直接与肿瘤细胞相互作用，以及肿瘤细胞-PC通讯在BC中起什么作用。

实验设计

图1 流程图

结果

1. PCs与患者生存和对免疫治疗的反应有关

本章节作者基于TCGA-BLCA bulk RNA-seq数据的细胞浸润推断分析。在单变量Cox回归模型中，11种免疫细胞类型与总生存期(OS)显著相关，在所有B细胞类型中，只有class-switched memory B细胞和PCs与更好的OS显著相关(图2A和B)。在抗PD-L1处理的IMvigor210队列中的B细胞中，只有PCs与较好的OS相关(图2C和D)。此外，免疫治疗应答患者的PC丰度相对较高(图2E)。这些基于大量测序数据的细胞推断结果表明，BC患者的高PC浸润预示着更好的OS和对免疫治疗的反应。

图2 从bulk RNA-seq数据推断的浆细胞浸润水平与生存和免疫治疗反应相关

2. IgG1和IgA1是BC中PCs的两个主要亚型

本章节作者纳入了一个scRNA-seq数据集来探索单细胞水平上PC的异质性。经过质控和细胞筛选，将其注释成三个大细胞亚群：上皮细胞(KRT18、EPCAM)，基质细胞(VWF、COL1A1)，免疫细胞(PTPRC、CD19、MS4A2)(图3A、B)。其中，依据PC标记物Cluster 11被鉴定为PCs(图3C、E)。与低级别患者相比，高级别患者的PCs减少(图3D上)。接下来，将未表达naive B细胞标记物的PCs进一步细分为7个簇(图3D下)，表明这些细胞都是成熟的PCs(图3E)。由于增殖相关基因MKI67的高表达，集群4被鉴定为质母细胞，而其他细胞主要表达IGHG1和IGHA1(图3F)。通过PCA进行基因降维后，我们发现几乎所有的PC都是高表达IGHG1和IGHA1的细胞，并且存在多个IgG亚型的细胞重叠。散点图也显示了两种细胞类型之间的显著差异(图3G)，表明IgG1和IgA1 PC是BC中主要的PC类型。为了进一步探究其功能特征，作者将IGHG1高表达、IGHA1低表达的细胞定义为IgG1 PCs，将IGHG1低表达、IGHA1高表达的细胞定义为IgA1 PCs。其中IgA1 PCs主要参与细胞周期相关的通路调控，而IgG1 PCs则显著参与免疫应答(图3G)。通过伪时间轨迹分析发现IgA1 PCs位于轨迹起点，IgG1 PCs主要位于轨迹末端(图3H)。同时，作者还发现IGHA1表达在轨迹结束时下降，而IGHG1表达增加(图3I)，这表明IgA1和IgG1 PCs之间可能存在类切换关系。进行细胞比例分析，作者发现在高级别疾病患者中IgA1 PCs增加，IgG1 PCs减少(图3J)。

图3 单细胞分析鉴定浆细胞亚群

3. 六种肿瘤细胞状态的鉴定

本章节作者使用非负矩阵分解法(NMF)将肿瘤细胞鉴定为六种状态。根据对单细胞的拷贝数推断分析，肿瘤细胞来自具有显著拷贝数变异(CNV)的上皮细胞(图4A)，来自高级别患者的细胞具有更高的CNV评分(图4B)。作者在BC中鉴定了六种肿瘤细胞状态(周期、基础、缺氧、部分上皮-间质转化[pEMT]、干扰素和应激)用于评估肿瘤细胞的内在功能特征(图4C和D)，发现不同状态的肿瘤细胞参与不同的调节功能(图4D)。尽管干扰素样肿瘤细胞的细胞比例最低，但它们的CNV评分最高(图4E)。

图4 用NMF鉴定六种细胞状态

4. 肿瘤细胞与PC间的串扰景观

本章节作者研究了所有细胞主要是肿瘤细胞与PC之间的通讯。在配受体(L/R对)分析中，MIF/ (CD74+CD44或+CXCR4)和APP/CD74的L/R对是肿瘤细胞到PC信号转导中最突出的相互作用(图5A)。此外，在基于抗PD-L1治疗队列的L/R对与患者OS的相关性分析中，一些L/R对介导缺氧样和应激样肿瘤细胞向IgG1 PC(如ANGPTL4/SDC1和LAMB3/ CD44)的信号转导，显示出与患者OS恶化的显著相关性，表明这些L/R对可能在接受ICB治疗的患者中发挥特定作用。另一方面，一些趋化因子信号相关分子(如CXCL10和CXCL11)与患者更好的OS相关(图5A)，这些趋化因子由pEMT样肿瘤细胞分泌，可能通过ACKR1促进IgG1 PC的募集。

作者进一步研究了58对参与肿瘤细胞与PC之间重要通讯的L/R对的表达水平。在TCGA-BLCA队列中，33个分子在肿瘤和正常样本中差异表达，其中64%的分子在肿瘤样本中上调(图5B和C)。在抗PD-L1治疗IMvigor210队列中，16个分子在治疗应答和无应答患者中差异表达，但在应答患者中只有40%的分子上调(图5B和C)。由此作者推测肿瘤细胞和PC之间的全局串扰可能促进癌症的发展，并与对ICB治疗的不良反应有关。

为了进一步选择肿瘤细胞和PC之间可靠的L/R对，作者使用空间转录组分析评估了它们在组织切片中的表达水平。基于L/R对的表达和生物学定位分析，作者鉴定出肿瘤细胞与PCs之间具有高可靠性的两个L/R对(LAMB3/CD44和ANGPTL4/SDC1)。然而，作者发现ANGPTL4低表达，这表明其可能仅由某些特定的肿瘤细胞分泌。作者检测了ANGPTL4在不同细胞类型中的表达，发现它在上皮(肿瘤)细胞中显著表达，在一些基质细胞中表达程度较低(图5E)。在样本来源分析中，在样本B5和B7中观察到ANGPTL4明显的样本偏倚，这可能与它们明显的缺氧水平有关(图5F和G)。缺氧条件诱导ANGPTL4表达。由此作者认为缺氧肿瘤细胞可能分泌ANGPTL4与SDC1+ PCs进行通讯，从而影响其分化、存活和抗体分泌。

图5 PC与肿瘤细胞之间潜在的配体和受体相互作用

5. 基于L/R对的风险模型构建

在这一章作者进一步量化了肿瘤细胞和PCs之间的串扰模式，并评估了它们与患者生存和免疫治疗的关系。基于TCGA-BLCA队列，作者从58对参与肿瘤细胞与PC之间显著通讯的L/R对中选取13个分子构建风险模型(图6A)，发现LR评分高组患者的OS明显较差(图6B)。在单因素Cox分析中，Stage、T Stage和N Stage也与OS显著相关(图6C)，而在多因素Cox分析中，剔除混杂因素后，LRscore是唯一独立的BC患者预测因子(图6C)。1年、3年、5年、7年和10年生存率的tdROC曲线下面积(AUC)表明，LRscore是比Stage、T Stage和N Stage更稳定有效的指标(图6D)。此外，在BC患者中，高LRscore也与较差的DSS、DFS和PFS相关(图6E)，这表明LRscore也有预测患者复发和进展的潜力。作者进一步评估了LRscore对抗PD-L1治疗队列患者生存的影响，高LRscore也预示着更差的OS(图6F)。同时，高风险组对治疗有反应的患者较少(图6G)，这表明LRscore可能与患者对ICB治疗的反应较差有关。LRscore与TNB和TMB 的显著负相关进一步验证了这一发现(图6H)。此外，模型分子ITGA6、HSPG2、LAMB1和SDC2的表达在应答患者中较低，这些分子的低表达与较差的OS相关(图6I和J)。这些模型分子可能是该模型成功预测抗PD-L1治疗队列免疫反应的主要原因。最后，作者评估了LRscore与其他免疫治疗相关预测因子(TNB、TMB、PD-L1、PD1和PCs)的预测效果(图6K)。LRscore联合TNB和TMB获得最高的AUC，诊断特异性为85.7%，可用于避免患者过度免疫治疗。

图6 基于配体(L)和受体(R)的风险模型LRscore是一个很好的预后和免疫预测因子

6. 评估风险模型

为了更好地分析LR风险模型的特征，作者基于TCGA-BLCA队列评估了LRscore与癌症特征之间的相关性(图7A)。LRscore与大多数癌症标志呈正相关，如上皮-间质转化、血管生成、刺猬信号和缺氧。免疫细胞浸润分析显示，LRscore与大多数肿瘤抑制T细胞类型(图7B)和IPS 呈负相关(图7E)。IPS是一种免疫原性评价指标，IPS越高，免疫治疗效果越好。然而，LRscore与内皮细胞和基质细胞评分呈正相关，而与效应细胞(ECs)、免疫检查点(CPs)或整体免疫评分呈正相关(图7C和E)。更重要的是，LRscore与肿瘤免疫功能障碍及排斥(TIDE)评分之间也存在显著正相关，这种相关性主要来自于排除和CAFs，而非功能障碍(图7D)。这些数据表明，LRscore反映的免疫抑制状态可能主要是由于肿瘤基质对免疫浸润的抵抗。

此外，低风险组的患者大多被分类为BC的经典Robertson-LumP和共识kamoun-LumP分子亚型，而高风险组则与恶性亚型相关，如Ba/Sq、Robertson-Neuronal和kamoun-NE样亚型(图7F)。在低风险组中，肿块亚型显示出高的FGFR3突变频率(图7G)。作者还基于GDSC药物数据库对不同风险组进行了药物敏感性分析，低风险组患者对FGFR3靶向药物(如PD173074和AZD4547)的敏感性更高(图7H)。FGFR3可能成为低风险组患者的药物靶点。总的来说，这些数据表明，高LRscore预示着患者的高免疫排斥和低免疫原性，这表明较差的免疫治疗反应和OS，但低LRscore的患者可能具有更好的免疫和靶向治疗结果。

图7 LRscore与癌症进展、微环境、癌症亚型和体细胞突变的关系

小结

在这项研究中，作者首先对来自8名患者的41894个细胞进行了scRNA-seq调查，并探索了肿瘤细胞与PCs之间的通讯模式；接下来，作者进一步通过空间转录组表达分析鉴定了关键配体/受体对，以阐明特定状态的肿瘤细胞与PCs之间的串扰；最后，作者量化了肿瘤细胞和PCs之间的总体串扰，以评估其对患者生存和对ICB治疗的反应的影响。这种多维综合分析为BC患者PCs的细胞异质性和串扰模式提供了前所未有的见解。

总之，作者通过整合scRNA-seq、bulk RNA-seq和空间转录组数据，系统地表征了BC中肿瘤细胞和PCs之间的串扰模式，并量化了这种串扰对患者生存和免疫治疗反应的潜在影响，基于L/R对的LRscore风险模型可用于预测临床风险和免疫反应。

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8+bulk结合单细胞公共数据库挖掘纯生信 #3459

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