玩转lncRNA辅助临床诊断和预后分层

玩转lncRNA辅助临床诊断和预后分层 by 生信人

引言

食管癌发现时往往处于晚期，疾病进展快死亡率高，如果能早预防、早发现并早治疗，可有效提高患者生存率。目前内镜检查和血清学筛查是主要的检查手段，急需一种更高灵敏度、更高特异性的无创早期筛查方法。lncRNA作为调控基因表达的重要因子，在不同癌症患者中存在特异性表达，且在血液中能被检测到，作为肿瘤特异性标志物具有巨大潜力。今天给大家分享一篇发表在”Nature Communications”(IF=16.6)杂志上的文章” The transcriptional landscape and diagnostic potential of long non-coding RNAs in esophageal squamous cell carcinoma”，本文重点研究lncRNA在食管鳞癌中的诊断和预后价值，并开发了基于6个lncRNA的预后模型MLMRPscore和基于5个循环lncRNA的早期筛查生物标志物，其功效均在另外独立的队列中得到验证。

一、背景介绍

食管癌发生率和死亡率在世界排名分别是第7和第6，在中国排名分别第6和第5，食管鳞癌（ESCC）是其主要亚型，早期无症状发现时往往是晚期。目前基于内镜筛查和血清学标志物对高风险人群进行的早期检查，可有效提高患者的5年生存率。但血清学检查特异性低，内镜检查要求具备专业设备和技术人员，而无创早筛生物学标志物的开发可将癌症发现时间提前，早治疗可显著提高患者生存率。

lncRNA是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA，是调节基因表达、染色质重组和翻译后调控的关键介质，其数量远远超过蛋白编码基因。其在不同癌症类型、同类癌症不同亚型中具有表达特异性，且在血液样本中也能检测到大量的lncRNA。之前有小样本研究发现HOTAIR血清学水平能将健康对照和患者区分开来，诊断能力为0.793，因此lncRNA作为肿瘤特异性生物标志物具有巨大的潜能。

二、研究方法及结论

来自北京医学科学院和温州医科大学的研究人员，对93名ESCC患者的配对肿瘤和正常组织标本的全转录组测序数据进行回顾性研究，研究其中长链非编码RNA的转录景观，并鉴定了6个关键的肿瘤特异性lncRNAs，并将其整合到Multi-LncRNA恶性肿瘤风险概率模型(MLMRPscore)中。MLMRPscore在多个内部和外部多中心验证队列(包括早期I/II期癌症)中，在区分ESCC与正常对照方面表现强劲。此外，在血浆队列中，5个候选循环lncRNAs被证实在识别ESCC和EIN（食管上皮内瘤变）方面具有非侵入性诊断潜力，显示出优于或与当前临床血清学标记物相当的诊断准确性。总的来说，本研究证明了lncRNAs作为ESCC早期检测的非侵入性生物标志物的潜力。

三、研究成果

1.研究设计和样本收集

本文针对食管鳞癌诊断中的lncRNA生物标志物进行了多中心、跨平台的临床发现和验证研究（图1）。在发现阶段，在山西省肿瘤医院93名ESCC受试者的回顾性病例队列（简称 SCH 发现队列）中鉴定候选 lncRNA 生物标志物（图1.上），通过整合多个lncRNAs基因表达来诊断SCH队列中的ESCC，建立恶性肿瘤风险概率模型(MLMRPscore)（图1.中）。在验证阶段，MLMRPscore的诊断性能在不同的多中心和跨平台回顾性队列中进行评估和检查，包括三个内部队列（SCH验证队列(n=62)、中国科学医学院(CAMS)组织样本队列(n= 15)和CAMS血浆样本队列(n=77)），两个公共RNAseq队列，来自You研究（称为You队列，n= 23）以及TCGA和GTEx数据库（称为 TCGA-GTEx队列，81名ESCC与271名健康捐献者），来自Li的研究的两个公共微阵列队列（称为Li队列1，n=119和Li队列2，n= 60）（图1.下）。

图1.整体研究流程

2.ESCC相关lncRNA鉴定

SCH队列中93名ESCC患者肿瘤和配对癌旁对照组织的进行lncRNA的差异表达分子，共鉴定出2103个显著差异表达基因（DElncRNAs），其中1070个相比对照上调，2103个基因下调（图2A），且所有差异表达基因的聚类结果显示能够将ESCC和正常对照明显区分开来（图2B）。为了缩小基因数量并鉴定最具信息性的lncRNAs，使用RF-RFE算法结合10倍交叉验证和5次重新取样，并鉴定了7个DElncRNAs作为潜在的生物标志物。对这7个lncRNAs在基于microarray平台的Li队列1中验证发现，其中6个（AP003548.1、PGM5-AS1、ADAMTS9-AS1、MIR503HG、LINC01082和LINC03016）具有一致的差异表达趋势，其中MIR503HG过表达，其余5种lncRNAs表达下调（图2C）。功能富集分析显示，对与六个lncRNAs共表达的mRNAs的功能富集在许多已知的癌症相关途径中富集，例如cGMP-PKG信号传导途径、Apelin信号传导途径、局部粘附和癌症中的转录失调（图2D）。

图2.SCH发现队列中全基因组范围发现ESCC相关lncRNAs标志物

3.综合多个lncRNA基因表达模型MLMRPscore的建立和内部队列验证

综合6个lncRNAs的基因表达量，临床医生可以使用SCH发现队列中的转化logistic回归模型评估ESCC的风险概率。在内部另一个SCH队列中进行了验证，结果显示MLMRPscore在区分ESCC与非癌组织方面表现出超强的区分性能，AUC为1（图3A-C）。利用RT-qPCR方法对来自CAMS的15对ESC和癌旁组织，验证上述六个lncRNAs的表达水平，对比发现，与SCH发现队列结果一致，组织标本中五个lncRNAs（AP003548.1、PGM5-AS1、ADAMTS9-AS1、LINC01082和LINC03016）显著下调，MIR 503HG显著上调（图3E）。MLMRPscore AUC为0.978，灵敏度为93.33%，特异性为93.33%，15例中有2例样本预测错误（图3D、F）。

图3.用于ESCC诊断的lncRNA多基因模型的内部队列开发和验证

4.在外部多中心和跨平台队列中独立验证MLMRPscore

对来自不同平台且相互独立的四个外部队列，盲测验证MLMRPscore的诊断性能。You队列中23名韩国ESCC患者预测结果显示，MLMRP评分在区分ESCC和配对正常对照方面表现强劲，AUC值为0.968，23例中的8例预测错误(图4A-C)。在包含81例ESCC和271例正常食道黏膜上皮组织对照的大型联合队列TCGA-GTEx中的预测结果显示，AUC值为0.951，敏感性为86.42%，特异性为84.13%，其中54例预测错误(图4D-F)。上述6个lncRNAs在You和TCGA-GTEx队列中的表达模式是一致的，正如在不同的内部队列中观察到的一样(图4B、E)。

对另外两个独立的来自中国的回顾性ESCC队列（Li cohort-1(n=119)和Li cohort-2(n=60)）计算MLMRPscore，再次证明其能够区分ESCC和对照样本。在Li cohort-1队列中，AUC为0.997，敏感性89.08%，特异性99.16% (图4G-I)，在Li cohort-2队列中，AUC为1，敏感性90.00%，特异性100.00%(图4J-L)。与SCH的发现和其他验证队列一致，六个lncRNAs基因显示了一致的失调表达模式(图4H、K)。这项多中心和跨平台的验证研究再次强调了MLMRP评分的可靠和稳健的诊断效能。

图4.外部多中心多平台队列中验证MLMRPscore模型准确性

5.MLMRPscore模型可靠识别出stage I/II ESCC患者

MLMRPscore与临床特征相关性分析显示，MLMRPscore 预测患者的风险概率显着高于对照组，但两组之间在饮酒、吸烟和不同队列中的性别差异方面没有显着差别。

早期肿瘤诊断对于降低食管鳞癌死亡率和改善预后至关重要，将队列中患者分为I期和II期（早期）与III期和IV期（晚期），并评估 MLMRPscore 的早期诊断性能。如图5所示，MLMRPscore在区分SCH发现队列中的早期（I期和II期）ESCC病例与正常对照方面也表现出卓越的诊断性能，AUC为1，敏感性100%，特异性100%（图5A)；CAMS组织队列中AUC为0.973，敏感性100%，特异性93.33%(图5B)， You队列中AUC为1，敏感性100%，特异性95.65%（图5C）；TCGA-GTEx队列中的AUC为0.944，敏感性83.33%，特异性92.62%（图5D），Li cohort-1队列中AUC为0.999，敏感性84.91%，特异性100%（图5E）；Li cohort-2队列中AUC为1，敏感性85.29%，特异性100%（图5F）。以上结果共同证明了 MLMRPscore 作为一种有前途的早期诊断工具的潜力。

图5.MLMRPscore早期诊断性能的验证

6.血浆样本队列中lncRNAs标志物的诊断潜能

基于组织样本的lncRNAs生物标志物是否在血浆样本中同样具有诊断能力，对此测量了来自CAMS血浆队列的32名ESCC患者、32名健康对照和13名EIN患者血浆样本中6个lncRNAs的表达水平。结果发现，其中5个lncRNAs(AP003548.1、PGM5AS1、ADAMTS9-AS1、LINC01082和LINC03016)显示出跟组织一致的异常表达模式(图6A)。基于这5个lncRNAs的生物标记物在区分ESCC患者和健康对照组方面表现强劲，AUC值在0.733到0.836之间，区分上皮内瘤变患者和健康对照组，AUC值在0.697到0.870之间(图6B、C)。另外比较了这五种lncRNAs生物标记物与传统血清肿瘤标记物(SCC-Ag、CEA和CYFRA21-1)的诊断效率，发现lncRNA在识别ESCC或EIN患者方面表现出更好或相当的诊断准确性(图6B、C)。这些结果表明，lncRNA生物标志物有可能成为早期诊断ESCC的无创性工具。

图6.lncRNAs生物标志物在血浆样本队列中的诊断潜能

7.基于lncRNAs的生物标志物与目前筛查方法的比较

食管鳞癌患者的筛查和诊断传统上依赖于内窥镜筛查或侵入性活检，然后再进行手术。为了评估lncRNAs生物标志物的临床益处，进行DCA（Decision curve analysis）以确定将这些lncRNAs纳入临床决策是否会带来更多的好处。如图7所示，DCA曲线表明，在一定的阈值概率范围内，与筛查和诊断所有ESCC患者或不筛查任何患者相比，lncRNAs标志物获得了更高的净效益(图7)。这些结果表明，通过将身体伤害和误诊的风险降至最低，lncRNAs标记物有可能提供比对所有病例进行干预或根本不干预更大的临床益处。

图7.lncRNAs生物标记物与目前的筛选方法相比具有实质性的优势

四、总结

临床诊断要求操作简单、成本低、数据准确，许多lnRNAs已经在癌症患者的血液中被鉴定出来，可以作为一种潜在的非侵入性诊断工具，且循环lncRNAs的诊断能力已被证明比传统的糖蛋白标志物、循环肿瘤细胞(CTC)和游离细胞DNA (cfDNA)更可靠和优越。本研究利用系统的、多中心、跨平台的临床生物标志物发现和验证框架，开发了一个稳定而强大的lncRNA多基因诊断特征（MLMRPscore），能够准确识别ESCC患者，包括临床队列中的早期肿瘤，并在不同的独立队列中对其进行了验证。基于MLMRPscore的5种循环lncRNAs在识别ESCC和EIN患者方面表现出稳健的性能，为未来无创ESCC检测方法奠定了基础。

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玩转lncRNA辅助临床诊断和预后分层 #3667

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