科研利器：如何使用CRISPR screening实现精准的大海捞针？

科研利器：如何使用CRISPR screening实现精准的大海捞针？ by 果子学生信

果子荐读

很多团队的leader对生物信息有偏见，觉得生信是华而不实的技能。
而我理解的生信是高通量的实验。

我拿他莫昔芬耐药的机制研究来举个例子，
首先课题组获取了莫昔芬耐药的乳腺癌细胞株，这个事情是明确的。
接下来，我们要做的事情是，搞清楚他为什么会耐药，以及如何打破耐药，研究好了就可以博士毕业了。
那通常我们是怎么做的呢？可能有这么些情况。
1.看文献：找到一篇高分文献，里面研究了一个跟耐药十分相关的分子A，所涉及的通路跟乳腺癌既往耐药的有交集，准备拿过来试试
2.课题组基础：前期已经找到了一个分子A跟耐药相关，但是师兄没有研究清楚机制，我准备接着做
3.课题组强行指定：研究分子A，因为咋们课题组就是研究分子A 的，什么都得往上靠，以后写国自然都可以算作前期基础。
4.放养，等死。

现在是，我们拿到这个分子A，对他进行敲减过表达，然后再看看是否能够打破耐药，如果影响耐药，咋们就往经典通路靠，最后能发一个3-5分的文章，顺利毕业。
这种情况，在多个课题组轮番上演，他们最终都说自己发现的分子A，B，C，D都跟耐药相关，做是做不完的，因为人类的编码基因就有2万个。

那么有没有什么方法，可以一次性并行完成2万个基因的耐药实验呢？
有的，就是今天介绍的CRISPR screening的技术。

这个技术，我个人觉得未来会是科研人员的标配。有了它，研究的原创性就有了保障，对于理解疾病和发现机制是神器。值得花时间研究。
哪怕不做，也要了解一下。

以下是正文

某天晚上我和师妹在微信上描述CRISPR screening实验时，她表示惊叹说，师姐这难道不是精准的大海捞针吗？
因此本期我们的文章标题使用了师妹非常精辟的描述。
在平时，我们要研究某基因的功能只能通过单独敲低/敲除、过表达的方式，
而CRISPR screening允许我们同时进行上万个这样的操作，一次搞定基因组范围的基因编辑，确可谓：精准大海捞针。

1. CRISPR Library

高通量是新时代生物技术的标配，从能一次完成超过5万个基因的PCR（RNA-seq）到细胞谱系追踪（barcoding），在不影响研究精准度的情况下，大大的降低科学研究时间和成本。依据我们前面的介绍，sgRNA将Cas9蛋白靶向至目的序列，Cas9结合到DNA上后剪切DNA，那么以下这几种情况则非常好理解：
（1）Cas9 + 1个sgRNA：针对一个基因进行编辑；
（2）Cas9 + 2个sgRNA：可针对两个基因进行编辑，或者可敲除两个sgRNA之间的大DNA片段；
（3）Cas9 + 多个sgRNA：可同时对多个基因进行编辑；
（4）Cas9 + 上万个sgRNA：同时对上万个基因进行编辑。

针对第3、4种情况，这多个sgRNA的合集被称为CRISPR文库（CRISPR Library），文库的大小可从几十个sgRNA到十几万个sgRNA。
文库的出现使得我们可以同时对上万个基因进行编辑，再筛选出对某特定表型有明显作用的基因集，用于指导下一步研究，这一过程称为CRISPR screening，
举例如下图：

从上图中可以看出，CRISPR Library是包含sgRNA的pool（A-C），
并通过慢病毒转导的方式转入Cas9稳定表达或野生型细胞（D），pool sgRNA感染的细胞经过特定特征（耐药性等）区分后，通过NGS测序鉴定与特定特征相关的基因集。
除了常规流程的展现，我们还需要注意到构建pool library的工作量是相当大的，如张峰教授组的GeCKO v2 Library可针对19,050个编码基因，而为了提高编辑效率，每个基因都设计了至少6个sgRNA，因此整个library包含有123,411个sgRNA，每个sgRNA都要构建出相应质粒，整个library的构建花费不菲，而我们只需要用500美元即可从Addgene上购得，能够使用这样的工具，真得感谢这些巨人们。

2. CRISPR Library的类型

CRISPR Library的类型也根据实验目的、物种、文库大小和投递方式分类，具体信息可以在Addgene网页上可以查看，还需要注意CRISPR Library不仅仅可以针对编码基因，对于非编码基因如LncRNA等也是有library的。

在设计CRISPR screening实验之前需要思考以下问题：
（1）CRISPR Library的扩增需要用电转的方法，并需要NGS测序来确定文库丰度，尽管目前已经有一些library可以选用化学感受态细胞进行扩增，但大部分还是需求使用电转感受态细胞；
（2）CRISPR screening实验需要大量的细胞，因此对于一些无法扩增、数量有限且非常珍贵的细胞、，如原代细胞等，CRISPR screening则可能不适用；
（3）大多数CRISPR文库需要使用慢病毒将gRNA/Cas9传递到目标细胞，需确认实验室能否操作慢病毒这样生物危害的实验。

使用者需充分考虑课题组的条件是否达到以上要求，一旦确定实验条件符合，
那么下一步就是library的选择，在选择文library时，也需要考虑以下几点：
（1）基因修饰的类型：敲除、激活还是抑制目标基因；
（2）gRNAs的数量：CRISPR Library可以针对整个基因组或某一类特定的基因，例如张峰组的GeCKO是针对基因组的，而最近报道的用于增强CRT T细胞在实体瘤中活性的TCR pool knockin CRISPR Library，只有36个目的基因；
（3）物种：特定的CRISPR Library中的gRNAs对于特定生物体的基因组是唯一的，并且文库只与来自该生物体的细胞兼容，例如人类的library只能用于人类细胞，小鼠则只能用于小鼠；
（4）library骨架：如骨架中已有Cas9，则直接使用即可；如骨架中无，需要搭配使用Cas9质粒或者要求细胞本身就表达Cas9，这将增加实验周期和难度。

3. CRISPR Library的结构

大部分的CRISPR Library都需要使用慢病毒投递系统，一般人类library都类似这俩种骨架：LentiCRISPR和lentiGuide-Puro（如下图）等，区别在于前者的骨架中已带有Cas9，因此是一个质粒系统；而后者需要叠加使用一个Cas9质粒或者要求细胞本身就稳定表达Cas9。

4. CRISPR Library设计和实例介绍

在文章TSC1 and DEPDC5 regulate HIV-1 latency through the mTOR signaling pathway 中，
作者为探讨调控HIV病毒潜伏的关键基因，作者首先构建HIV的荧光报告细胞（HIV-1 proviral DNA+GFP），
当HIV病毒复制的时候，GFP也同时表达，因此可以通过绿色荧光来观测HIV病毒的活动情况。

在HIV-GFP报告细胞中，转入sgRNA library进行大规模基因敲除，一定时间后用FACS分选出强绿色荧光表达细胞，经过4个循环后则得到了低荧光（HIV潜伏）和高荧光（HIV活动）两组细胞，通过NGS测序发现两组细胞中的sgRNA丰度情况，经过3次重复后得到257个基因对HIV病毒活动有正向作用，最后通过数据分析筛选出TOP的gene集。后续可针对TOP基因集进行针对性的验证。

通过这个例子，我们还可以想象，把GFP细胞换成肿瘤药耐药细胞如厄洛替尼，将FACS分选换成给药+不给药两组，一定时间后检测两组细胞的sgRNA丰度差别，则可以找到厄洛替尼耐药相关的基因。

5. CRISPR Library实验的一些心得

除了需要一个非常明显的可以作为区分的特征之外（即非常好的模型），例如荧光报告细胞、重要药物耐药等，还需要注意以下一些细节问题：

（1）需要注意骨架中的启动子是否适合自己的目的细胞，例如CMV启动子非常广谱，但对于人胚胎干细胞的效率则非常低，需要选用带有EF1α启动子的骨架。
（2）部分library要求细胞本身就表达Cas9，这本无可厚非，但部分细胞在高表达Cas9的情况下非常脆弱，这时候需要考虑使用inducible Cas9 system，而这个系统的构建本身就是有难度的实验，因此在设计可提前一定要做好全面分析。
（3）Library扩增工作量非常大，需要尽可能的严格按照protocol进行，并且配备质粒超大提试剂盒，部分Library要求使用特殊的感受态细胞，而该细胞只有国外出售并且非常昂贵（我们还不一定能买到）。
（4）由于Library非常庞大，慢病毒的包被也是大批量的，如果使用Lipo3000或者Roche的转染试剂则花费非常大，此时可以考虑使用PEI40000等便宜且效果又好的转染试剂。
（5）此外，慢病毒的包被需要选择状态好且代数低的293T细胞，如果有293FT细胞则效果更佳（关于293的选择，公众号有一篇专门阐述：团队作案HEK293，史上最强搬砖细胞）。
（6）考虑筛选标记的冲突，例如目的细胞是通过慢病毒转染的方法稳定表达Cas9，且筛选标记是puromycin，那么几乎所有的Library的抗性筛选基因都是puromycin，这就冲突了。

具体更多的细节还需要我们去发现。

ixxmu / mp_duty