你是我的眼 || 单细胞测序在眼科中的应用大观览

你是我的眼 || 单细胞测序在眼科中的应用大观览 by 单细胞天地

单细胞测序技术可以在单细胞分辨率上获得细胞内各种生物信息，目前该技术已在肿瘤学、免疫学以及神经学等多个领域应用广泛，但关于眼科疾病的单细胞研究还处于早期阶段，目前该疾病领域的单细胞测序文章主要围绕以下几个方面：构建视网膜图谱，探索糖尿病视网膜病变、青光眼、年龄相关黄斑变性发病机制等（见表1）。但是，在眼科领域尚有许多眼部疾病缺少单细胞方面的研究，未有文章发表，同时各类细胞在疾病发生发展过程中的相互作用也亟需揭示。随着单细胞测序技术的成熟，可通过单细胞测序技术研究眼部各类疾病，深入的了解疾病的发病机制，为疾病的治疗提供新的思路。

表1 眼科相关单细胞测序文献

大多数不可逆的失明是由视网膜疾病引起的，这也是为什么目前视网膜相关疾病单细胞测序文献最多。视网膜属于中枢神经系统的一部分，含有60余种神经元，在视觉图像的产生过程中起重要作用。人类的视网膜有两个不同的区域，视网膜周边主要负责夜视和运动视觉，中央凹也称为黄斑，位于视网膜中心对阅读和面部识别至关重要。

视网膜虽然厚度仅有0.1~0.5mm，但结构十分复杂，视网膜主要由4层细胞组成，从最外层向内分别为色素上皮层、感光细胞层、双极细胞层和神经节细胞层。色素上皮层不属于神经组织，含有黑色素颗粒和维生素A，对相邻感光细胞起着营养和保护作用，黑色素颗粒能吸收光线，防止光线反射而影响视觉，也能消除来自巩膜侧的散射光线。感光细胞层包括视椎细胞和视杆细胞，视锥细胞可感受弱光，能在昏暗的环境中感受光刺激而引起视觉，区别明暗，视杆细胞可感受强光并具有色觉，能分辨颜色，主要在白天或较光亮的环境中起作用。在视网膜信号的传递中，双极细胞具有两个重要功能：一是把视觉信号分流为给光(ON)和撤光(OFF)信号；二是通过其与无长突细胞和神经节细胞的特殊的突触传递方式，把持续性的分级电位转化为瞬变性的神经活动。神经节细胞接收双极细胞的传入信息，其轴突形成视神经。

图1 视网膜中的细胞类型

案例一

单细胞转录组绘制成人视网膜细胞图谱

标题：A single-cell transcriptome atlas of the adult human retina

期刊：EMBO J

影响因子：11.598

发表时间：2019年

研究目的：构建成人视网膜单细胞转录组图谱

样本信息：3位捐赠者的视网膜样本

捕获细胞数：20009个细胞

结论：在单细胞水平上描述了成人视网膜的转录组特征，识别了所有主要人类视网膜细胞类型（包括：视杆细胞、视锥细胞、穆勒胶质细胞、视网膜星形胶质细胞、小胶质细胞、双极细胞、神经节细胞、无长突细胞和水平细胞），构建成人视网膜单细胞图谱，为深入了解人类视网膜细胞的转录景观提供了参考，对了解视网膜相关疾病具有启发意义。

图2 正常人和视网膜单细胞测序图谱

案例二

单细胞测序技术揭示小胶质细胞在增殖性糖尿病伴发视网膜病变（PDR）中的关键作用

标题：Single-cell transcriptomics reveals novel role of microglia in fibrovascular membrane of proliferative diabetic retinopathy

期刊：Diabetes

影响因子：9.461

发表时间：2022年

研究目的：利用单细胞测序解析PDR患者的发病机制，寻找潜在治疗靶点。

样本信息：5例PDR患者的纤维血管膜

捕获细胞数：6894个细胞

结论：发现小胶质细胞在FVMs组织中具有重要作用，FVMs中的小胶质细胞起源于视网膜小胶质细胞，且表现促纤维化特性和本身纤维化特性。这些结果为更好地了解人类FVMs的细胞组成和功能以及未来介入靶点的发展提供了理论基础。

图3 PDR患者纤维血管膜单细胞测序图谱

案例三

正常人和黄斑变性患者视网膜色素上皮和脉络膜的单细胞转录组测序

标题：Single-cell transcriptomics of the human retinal pigment epithelium and choroid in health and macular degeneration

期刊：PNAS

影响因子：11.2

发表时间：2019年

研究目的：使用单细胞RNA测序阐明RPE和脉络膜内基因表达的表达情况，以进一步了解年龄相关性黄斑变性（AMD）的发病机制。

样本信息：7例捐献者视网膜外周和黄斑的RPE/脉络膜，队列1:3名患者，队列2:4名患者视网膜外周和黄斑的RPE/脉络膜分选CD131进行单细胞测序。

捕获细胞数：队列1（4335个细胞）、队列2（14234个细胞）。

结论：构建了RPE和脉络膜细胞图谱，包括Schwann细胞、黑色素细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、RPE细胞、B细胞、T/NK细胞、巨噬细胞和肥大细胞。黄斑处和外周视网膜RPE细胞和周细胞的基因表达差异是明显的。本研究提供了RPE和脉络膜内基因表达的信息，对于我们了解脉络膜血管损伤在黄斑变性中的作用提供了重要信息。

图4 成人黄斑变性患者视网膜色素上皮和脉络膜单细胞测序图谱

案例四

单细胞测序描绘房水流出通道的细胞图谱

标题：Cell atlas of aqueous humor outflow pathways in eyes of humans and four model species provides insight into glaucoma pathogenesis

期刊：PNAS

影响因子：11.2

发表时间：2020年

研究目的：青光眼是世界范围内导致不可逆失明的主要原因，并且伴随有视网膜神经节细胞(RGCs)的缺失，目前降低眼压是唯一有效的治疗策略。使用单细胞RNA测序解析青光眼疾病机制的发病机制，了解不同组织控制眼内压升高导致RGC损失的过程。

样本信息：人（从6名死后供体7只眼中分离的成人小梁网（TM）和周围组织中获得24023个细胞），恒河猴（5158个细胞），食蟹猴（9155个细胞），普通猪（6709个细胞）和小鼠（5067个细胞）视网膜前端组织。

结论：本研究构建了人类和四种模型动物小梁网及其周围结构的细胞图谱，确定了每种细胞类型的标记物，深入研究了这种复杂组织的各个组成部分，并揭示了免疫环境和小梁网流出途径的特征。本研究还为全基因组关联研究中确定的易感位点提供了生物学背景。以上结果可以指导人类和动物模型青光眼的进一步研究。

图5 人小梁网和房水流出结构的细胞图谱

案例五

单细胞测序揭示人类与类恒河猴视网膜衰老细胞图谱

标题：A single-cell transcriptome atlas of the aging human and macaque retina

期刊：Natl Sci Rev

影响因子：17.28

发表时间：2020年

研究目的：了解视网膜衰老进程中细胞组成及其内在基因调控网络变化。

样本信息：6例不同年龄阶段健康人视网膜（38558个细胞）、5例不同年龄阶段健康恒河猴视网膜（80962个细胞），视网膜分成中间凹（中间凹中心直径1.5-2.0 mm内）和外周视网膜（中间凹中心直径5.0 mm以外），其中中间凹细胞共捕获45231个细胞，视网膜外周共捕获74289个细胞。

结论：通过对不同年龄段人类及非人灵长类恒河猴视网膜进行单细胞转录组测序，解析了人类与恒河猴视网膜在细胞水平和分子水平的异同，并建立了人类及恒河猴视网膜衰老的分子图谱，发现了人视网膜在衰老过程中细胞组成改变及关键分子特征，为治疗和干预年龄性相关视网膜疾病提供了重要的研究基础。

图6 人和恒河猴视网膜单细胞图谱

案例六

单细胞揭示人类视网膜和体外视网膜类器官的细胞类型

标题：Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution

期刊：Cell

影响因子：41.58

发表时间：2020年

研究目的：对视网膜和视网膜类器官的细胞分化类型进行比较。

样本信息：通过对类器官F49B7在7个发育时间点（6、12、18、24、30、38和46周）的82938个单细胞的RNA进行测序；并对光反应性成人视网膜的外周(n=6)、中央凹(n=5)和类器官（8个F49B7和13个IMR90.4）进行对比分析。

结论：发现类器官中的细胞类型在体外成熟到稳定的“发育完成”状态，进程与体内人类视网膜发育相似，类器官细胞类型的转录组趋同于成年外周视网膜细胞类型的转录组。进一步，研究人员发现，疾病相关基因的表达在成人视网膜中是细胞类型特异性的，而细胞类型特异性在类器官细胞中也得到保留，分析了细胞类型与黄斑变性等疾病之间的关系，本研究为类器官研究视网膜相关疾病的机制提供了新的模型和基础。

图7 成人视网膜及视网膜类器官单细胞图谱

本文小新带大家观览了单细胞技术在眼科研究中的应用，希望可以为眼科研究的科学家和临床医生带来单细胞世界的新见解~

参考文献

[1] Cowan C S , Renner M , MD Gennaro, et al. Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution[J]. Cell, 2020, 182(6):1623-1640.e34.

[2] Lukowski S W , Lo C Y , Sharov A A , et al. A single‐cell transcriptome atlas of the adult human retina[J]. The EMBO Journal, 2019, 38(18).

[3] Hu Z, Mao X, Chen M, et al. Single-Cell Transcriptomics Reveals Novel Role of Microglia in Fibrovascular Membrane of Proliferative Diabetic Retinopathy[J]. Diabetes. 2022;71(4).

[4] Voigt A P , Mulfaul K , Mullin N K , et al. Single-cell transcriptomics of the human retinal pigment epithelium and choroid in health and macular degeneration[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2019(48).

[5] Cell atlas of aqueous humor outflow pathways in eyes of humans and four model species provides insight into glaucoma pathogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 2020;117(19).

[6] Yi W , Y Lu, Zhong S , et al. A single-cell transcriptome atlas of the aging human and macaque retina[J]. National Science Review, 2020.