阿尔茨海默病下一代蛋白质组学技术：从临床研究到常规诊断

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阿尔茨海默病下一代蛋白质组学技术：从临床研究到常规诊断 by 生物标志物研究

生物标志物研究|第96期

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发表期刊：Expert Review of Proteomics

分类：神经医学，蛋白质组学

发表时间：2023年9月13日

研究机构：瑞典哥德堡大学萨尔格伦斯卡学院精神病学和神经化学系、瑞典萨尔格伦斯卡大学医院临床神经化学实验室

1. 简介

阿尔茨海默病（AD）是一种神经退行性疾病，主要表现为进行性破坏记忆和认知功能。斑块和缠结是AD的病理特征，斑块主要由β淀粉样肽（Aβ1-42）组成，缠结则由tau蛋白组成。AD还可能具有其他蛋白质聚集体，如α突触核蛋白和TDP-43。APOE基因与AD有较强的遗传关联，具有APOE ε4等位基因的人患AD的风险增加。

AD起始于临床前阶段，持续20年左右，逐渐出现轻度记忆和认知症状，最终导致AD痴呆。目前主要认为Aβ肽的产生和清除不平衡导致神经毒性肽低聚体形成，进而引发斑块形成和神经变性。靶向Aβ肽和低聚物的治疗性抗体已经在临床试验中显示出积极的效果，但治疗对认知的影响中等，并且费用高昂。

生物标志物是实现AD治疗的关键部分，可以识别早期临床阶段的患者，监测疾病进展和治疗效果，并区分AD和其他神经系统疾病。蛋白质组学在生物标志物的鉴定和对病理过程机制的理解方面发挥重要作用。

目前对于AD标志物的研究主要集中在脑脊液（CSF），CSF与大脑细胞直接接触，可以反映与神经系统疾病相关的过程。目前，CSF生物标志物已经用于临床评估，主要包括Aβ1-42/Aβ1-40比值降低、p-tau升高和t-tau增加。血液作为更容易获得的样本，也在开发其中潜在的生物标志物。

当前的蛋白质组学方法主要基于质谱技术，新兴的蛋白质组学技术有望为AD研究提供更多的生物标志物。

2. 挑战和要求

脑脊液和血液作为生物样品，具有一些共同的复杂性。首先，它们都具有较高的个体间生物变异性和个体内蛋白质浓度随时间变化的个体变异性，这导致结果差异很大，需要大型研究队列来验证候选生物标志物的统计学意义。其次，脑源性蛋白质通常很稀有，在脑脊液和血液复杂样本基质中进行检测和定量非常困难。脑脊液和血液中的其他蛋白质丰度超过脑源性蛋白质几个数量级，且只有很少一部分蛋白质与AD相关。

蛋白质组学技术需要能在合理的时间内分析包含数百个样本的大型临床队列，检测与AD相关的蛋白质丰度变化，满足统计学要求。同时，样品制备和分析必须具有可重复性，以确保不同样本之间的可比性。最后，蛋白质组学方法需要具有高检测灵敏度和深度覆盖，以便检测低丰度的目标标记物。

3. 基于MS的蛋白质组学

3.1. 基于标记的蛋白质组学

基于标记的蛋白质组学将稳定同位素化学标签与胰蛋白酶消化得到的肽结合，把多个样品组合进行多路复用分析。串联质量标签（TMT）技术是目前在AD生物标志物研究中广泛应用的方法。TMT蛋白质组学的优势在于多路复用，可以同时对多达18个单独样品进行肽定量，且减少了每位患者的所需样本量，在样本有限的情况下具有优势。在AD研究中已经利用TMT标记方法进行生物标志物研究，分析结果表明AD存在不同亚型，病理变化也有所差异。

TMT蛋白质组学也存在一些缺点，例如MS2谱图存在随机性，可能导致数据丢失；TMT标记的肽具有特定的物化性质，可能需要额外的工作来测量其未标记形式。

3.2. 非标定量蛋白质组学

在非标定量蛋白质组学研究中，通常使用肽丰度来衡量蛋白质表达水平，通过生成提取离子色谱图（XIC）和测量质谱信号（MS1或MS2）的色谱峰面积来实现。

非标定量方法不允许样品多路复用，因此每个样品都需要单独制备和分析。这可能导致分析误差，因为液相色谱-质谱（LC-MS）性能可能随时间而变化，但它允许在数据非依赖性采集（DIA）模式下记录MS数据，从而避免了与数据依赖性采集（DDA）相关的检测偏差。

为了确保非标定量蛋白质组学研究的运行间可比性，一些研究采用了自动化样品制备平台，并避免离线预分级分离步骤。这些研究的蛋白质组学覆盖率通常较低，但它们具有更高的通量和良好的稳健性。

已有的非标定量蛋白质组学研究有助于我们更好地理解阿尔茨海默病（AD）。研究发现，在AD患者与对照组的脑样本中，大约有200种蛋白质的丰度存在差异，AD患者脑脊液中存在一致的糖酵解特征，这可能具有潜在的临床应用价值。

新技术也被应用于AD蛋白质组学研究，例如使用捕获离子淌度（TIMS）-四极杆-飞行时间质谱（TOF）和平行积累-连续碎裂（PASEF）原理的diaPASEF技术，这种技术在离子采样能力方面明显优于传统的DDA和DIA方法，采用相对较短的梯度时间和微量样品，具有很好的临床研究价值。

3.3. 靶向质谱

生物标志物研究先通过初步探索性蛋白质组学，发现潜在的候选生物标志物，而其验证阶段比发现阶段往往更耗时，尤其使用免疫测定进行验证时还需要得到适当的抗体。

靶向质谱被提出作为一种更快、更有效的生物标志物验证方法，它可以利用先前的蛋白质组学研究中提取出的肽靶标完成。在AD生物标志物领域，选择反应监测（SRM）和平行反应监测（PRM）是常用的靶向MS测定方法，它们允许精确量化相关的蛋白质。

在AD生物标志物领域，靶向MS方法已经做出了重要贡献。基于PRM可以检测血浆和脑脊液中多种p-tau形式，揭示位点特异性磷酸化在AD疾病进展的不同时期发生，并展示不同的淀粉样蛋白和tau病理特征。这些方法还可以用于检测血浆Aβ1-42/1-40比率以预测AD患者和对照组的淀粉样蛋白状态。

4. 基于亲和性的蛋白质组学

在过去的十年中，基于亲和性的蛋白质组学在AD研究中变得越来越受欢迎。这种方法利用DNA寡核苷酸偶联的亲和试剂，如抗体或适配体，与特定蛋白质靶标结合，使用分子遗传方法检测和定量结合的蛋白质，可以同时定量数百到数千个蛋白质靶标。

基于亲和性的蛋白质组学平台包括Olink、SomaScan和新的NULISA平台。这些平台可以用于测量脑脊液和血浆中的蛋白质，从而发现早期AD的新生物标志物。例如，使用Olink ProSeek免疫测定法测量CSF和血浆蛋白，确定了早期AD的新标志物。另一项采用SomaScan技术的研究发现，某些血浆蛋白与AD诊断以及认知能力下降的速度相关。

与质谱（MS）相比，基于亲和性的蛋白质组学受到动态范围问题和数据丢失的影响较少，但蛋白质是间接测量，因此测量特异性可能受到脱靶等因素的影响。

有研究评估了三种蛋白质组学平台（SomaLogic SomaScan、Olink邻近扩展测定和基于TMT的MS）在AD脑脊液和血浆中的性能。结果表明，跨平台方法可使血浆和脑脊液蛋白质组学分析达到前所未有的深度。

5. 结论

关于AD的临床蛋白质组学研究主要集中在脑脊液，少数在血液中。大多数研究使用TMT技术，但随着LC-MS仪器技术的进步，越来越多的非标定量蛋白质组学方法被应用于临床研究。这些研究已经确定了几种生物标志物候选物，这些候选物可能反映了AD中不同的病理过程并能监测疾病进展。针对这些候选生物标志物已经建立了靶向MS检测，有助于验证其可行性，并在一些情况下支持临床实验室的诊断。

图1 截至2022年关于AD蛋白质组学研究的年度出版物数量

6. 专家意见

蛋白质组学在阿尔茨海默病（AD）临床研究中扮演着越来越重要的角色。新仪器、分析策略和生物信息学方法的发展推动了这一领域的发展。除了基于液相色谱质谱技术（LC-MS）的方法外，新一代基于超灵敏亲和性的技术也对新的候选生物标志物的鉴定作出了贡献。虽然脑脊液是目前主要的研究样本，但由于腰椎穿刺取样的侵入性和获取限制，血液中蛋白质组学研究的重要性也逐渐受到重视。已经发现了一些血浆和血清中的生物标志物，如不同形式的p-tau、淀粉样蛋白β1–42/1–40和神经丝轻链，它们在验证和表征方面还需要更多的研究，探索性发现和靶向验证被认为是解决这一问题的途径。此外，结合蛋白质组学与正电子发射断层扫描（PET）成像等技术的联合研究，可以将脑脊液中的蛋白质变化直接与病理变化相关联，从而提高生物标志物的病理相关性。尽管LC-MS在AD生物标志物分析中具有潜在优势，如高特异性检测和多靶向测量，但仍存在一些限制，需要克服LC-MS在界面和仪器性能上的稳定性问题。未来，随着仪器技术的进一步改进和应用技术的大规模推广，蛋白质组学在AD的临床研究中有望提供更多有价值的信息。

图2 生物标志物开发三阶段

参考文献

Weiner, S. et al. (2023) ‘Next-generation Proteomics Technologies in alzheimer’s disease: From clinical research to routine diagnostics’, Expert Review of Proteomics, pp. 1–8. doi:10.1080/14789450.2023.2255752..

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