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9 months ago Seurat V5的《Nature Biotechnology》 by Biomamba 生信基地
Biomamba荐语
今天要介绍的文章题为"Dictionary learning for integrative, multimodal and scalable single-cell analysis"，发表于《nature biotechnology》，影响因子42.2，正如题目呈现的那样，这篇文章正是近日饱受争议的Seurat第五版发布时发表的文章(不知道大家最近有没有受layer的苦呢，但其实该文今年五月就已经发表，只是最近V5变成了CRAN默认版)。本文描述一种名为“桥接整合（bridge integration）”的方法：利用多组学数据作为分子桥梁，跨模态地集成单细胞数据集。多组学数据集中的每个细胞构成了一个“字典”中的元素，用于重构单模态数据集并将其转换为共享空间。也就是说作者也注意到了层出不穷的单细胞多组学，并希望Seurat能够完成多来源、多组学数据的一站式整合分析。感兴趣的同学可以阅读一下原文。
Abstract
Introducion
Methods
Results
作为人类生物分子图谱计划（Human BioMolecular Atlas Program，HuBMAP）的一部分，作者利用公共数据集构建了一个全面的人类骨髓单个核细胞（BMMCs） 的 scRNA-seq 参考数据（'Azimuth reference'；297,627 个细胞），并仔细注释了 10 个祖细胞和25 个分化细胞状态（图2a）。图b是来自Granja等人的BMMCs scATAC-seq查询数据集的UMAP可视化。利用“桥接整合”技术将人的BMMCs scATAC-seq查询数据集（2b）映射到参考数据集（2a）中，实现了scATAC-seq和scRNA-seq数据的联合可视化（2c）。这里桥接的分子桥梁是一个包含 32,368 个细胞的 10x 多组学数据集。
作者发现桥接整合可以注释额外的罕见和高分辨率亚群。例如，作者的注释将单核细胞分为 CD14+ 和 CD16+ 亚群，将自然杀伤细胞分为 CD56bright 和 CD56dim 亚组，将细胞毒性 T 细胞分为 CD8+ 和粘膜相关不变 T（MAIT）细胞亚群。虽然这些细分在无监督的 scATAC-seq 分析中没有被发现，但作者通过在参考数据集的注释下观察到经典位点的差异可及性来确认这些预测结果（图2d、e、f），预测的细胞标签与预期的可及性模式一致。
①探索多组学数据集的大小和组成对整合准确性的影响
② 将“桥接整合”方法与其他整合方法（MultiVI49、Cobolt50）进行对比
（脊线图表示细胞的染色质可及性的相对强度或水平。脊线高度越高，表示染色质在该位置上的可及性越强，染色质更加开放。）
基准测试2：采用了最近发表的Paired-Tag数据集，该数据集使用scCUT&Tag同时测量了个体的组蛋白修饰结合谱和RNA转录组。对活性组蛋白修饰标记（H3K27ac）、抑制性组蛋白修饰标记（H3K27me3）和增强子组蛋白修饰标记（H3K4me1）的scRNA-seq和scCUT&Tag进行了跨模态整合。在每种情况下，桥接整合成功地将细胞在不同模态间进行整合，并返回了匹配的scRNA-seq和scCUT&Tag谱之间最高的Jaccard相似性和分类指标（右上及下方2张图）。
③探索“桥接整合”灵活性
为了进一步展示该方法的灵活性，使用桥接整合来映射和注释一个snmC-seq数据集，该数据集测量了人类皮层中单个细胞的DNA甲基化谱。作为参考，我们使用了Allen脑图谱中的一个数据集，该数据集定义了人类皮层中经过专家精心策划和多级别细胞本体论。使用snmC2T-seq数据集作为桥接，该数据集同时测量了甲基化和基因表达，对snmC-seq谱进行注释。即使基于参考的注释没有提高snmC-seq数据的无监督聚类分辨率，它们仍然增加了相当大的可解释性（Fig 3d-f）。例如，无监督聚类识别出多个层6（L6）神经元亚群（标记为L6-1、L6-2和L6-3），但通过RNA辅助注释，这些聚类被清晰地标记为“近投射”或深层新皮质6b兴奋性神经元（Fig 3f）。
（Fig 3d: 人类运动皮层的scRNA-seq参考数据集；Fig 3e-f: 使用snmC2T-seq多组学数据集作为桥梁将人类皮层细胞的单细胞DNA甲基化轮廓进行映射。细胞按照原始研究中的甲基化注释（e）或桥梁集成得到的scRNA-seq注释（f）进行着色）
●综上所述，这些结果证明了作者的桥接整合方法的准确性、稳健性和灵活性
3、使用字典学习进行大规模可扩展的整合
最近公开可用的单细胞数据集的增加给整合分析带来了挑战。例如，已经对多个组织进行了数十个研究的分析，涵盖了数百个个体和数百万个细胞。对单一器官的广泛（或全部）公开可用的单细胞数据集的整合挑战称为“社区范围”整合。尽管有丰富多样的分析方法可以整合数十万个细胞的数据集，但即使在分析单一模态时，进行无监督的“社区范围”整合仍然具有挑战性。
（原子素描图集成过程的示意图）
举例：利用上述方法进行人类肺部单细胞RNA测序的社区级整合
为了展示原子素描整合在进行“社区范围”分析中的潜力，作者对人类肺部的单细胞RNA测序数据集进行整合。借助最近发布的单细胞RNA测序研究数据库以及人类细胞图谱中公开发布的肺部和上气道数据集，作者汇集了19个数据集，总共包含1,525,710个个体细胞。创建了一个由每个数据集的5,000个细胞（总共95,000个原子）组成的原子字典，对这些细胞进行整合并重建了完整的数据集。
结果显示：
①与个体分析相比，结果展示了社区级整合的优势。首先，通过在数据集和技术之间匹配生物状态，整合的参考可以帮助标准化细胞本体和命名方案（Fig 4b、c）。（且使用原子素描图集成在55分钟内实现了数据的协调，速度很快）。
②社区级整合能够一致地识别出超稀有的细胞群体，尤其是在最近发现的在人类和小鼠肺中表达Foxi1的“肺离子细胞”群体（Fig 4d，FOXI1，肺离子细胞的转录标记）。
值得注意的是：通过素描或杠杆得分采样选择字典原子对于获得最佳性能是至关重要的；如果使用通过随机降采样确定的原子集进行重复分析，可以成功整合丰富的细胞类型，但无法整合离子细胞，因为它们在字典中的表示不够充分。
③社区级整合可以大幅提高细胞类型差异表达标记物的识别能力
作者按照样本复制品和细胞类型身份对细胞进行分组，并对得到的伪批量（pseudobulk）配置文件进行差异表达分析（Fig 4e）。确定了116个肺离子细胞的阳性标记物，代表了对该细胞类型的最深入的转录特征描述。这些标记物包括转录因子FOXI1等典型标记物，但还揭示了ATP酶（例如ATP6V1G3和ATP6V0A4）和氯离子通道（例如CLCNKA、CLCNKB和CFTR）的显著本体富集，支持了这些细胞在调节肺部化学浓度中的作用（图4f）。
另外，使用伪批量值的一个优点是增加了低水平基因表达的定量准确性。事实上，反复发现使用这种策略找到的顶级差异表达标记物往往能够捕获更多在较低平均表达值范围内的基因（Fig 4g）。
最后，作者对体外周血液细胞进行社区级整合，通过探索公开可用的COVID-19样本或健康对照组的研究，收集了14个包含单细胞RNA测序数据的研究，总共涵盖了639个个体的346万个细胞。其中11个研究的数据是从最近发布的标准化单细胞测序数据集合中获取的。对这些测序数据进行原子素描图整合，鉴定出30个细胞状态（Fig 5a）。并发现与先前的报告一致，COVID-19样本中的单核细胞显著上调干扰素应答基因的表达（Fig 5b）（30个细胞的scRNA测序数据集构建成功）。
单细胞测序技术能够在数千个单细胞中测量RNA转录本和细胞表面蛋白，而基于细胞学技术的方法（cytometry-based techniques，例如CyTOF）能够在数百万个细胞中测量细胞外和细胞内蛋白。作者获取了一个包含119个个体和总计5,170,249个细胞的CyTOF（蛋白质水平的飞行细胞术）数据集，利用之前收集的161,764个来自健康捐赠者的外周血单核细胞（PBMCs）的CITE-seq（一种综合了转录组和表位组分析的单细胞测序技术）数据集作为多组学桥梁，将CyTOF数据集映射到scRNA-seq数据集上（注：CyTOF和CITE-seq数据集都共享30个细胞表面蛋白特征，而CyTOF数据集还测量了17个独特的蛋白质，其中包括无法通过CITE-seq测量的细胞内靶标。）：
①桥接整合将每个CyTOF数据集与scRNA-seq数据集中的聚类标签进行了注释，该数据集包含了3,460,000个细胞，并且能够推断出每个聚类的细胞内蛋白水平（Fig 5c）。
②调节型CD4+ T细胞表达高水平的转录因子FOXP3，而效应T细胞则显示富集的KLRG1水平（Fig 5d）。以及在细胞毒性淋巴细胞群体中，MAIT细胞独特地缺乏细胞毒性蛋白酶粒酶B的表达。这些都说明了这种跨模态映射的准确性。
③最后，成功地注释了一种罕见的ILC（0.024%），这种细胞在CyTOF数据集中没有独立识别出来，但正确地表现出CD25+ CD127+ CD161+ CD56−的免疫表型（Fig 5d-e）。
Discussion
如果大家还是抵触Seurat的更新，可以考虑换回原来的版本：在Rstudio中使用同一个R包的不同版本，或者直接考虑转战Python：scRNA-Seq学习手册Python版。
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