肿瘤免疫分型这么分析更靓

肿瘤免疫分型这么分析更靓 by 生信人

今天跟大家分享的是最近发表在Frontiers in oncology 上的一篇文章，影响因子4.848。

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基于免疫基因集的膀胱癌四种免疫亚型的鉴定

首先让我们通过摘要了解下这篇文章的主要内容，膀胱癌的分子分类对其临床管理越来越重要，并且当前的分类主要是基于基因表达谱。那么在这篇文章中作者根据免疫相关基因集在三个独立数据集中的基因表达谱，确定了四种膀胱癌免疫亚型（简称C1-C4），并证明了这种分类是有效和可重复的。作者发现C2是免疫浸润型，C4是免疫“沙漠”型，并且C2亚型的生存率要好于其他亚型。此外，C2不仅对抗PD-1免疫抑制疗法最敏感，而且对吉西他滨和博来霉素等常规化学疗法也最敏感。C4亚型对化疗药物顺铂和阿霉素最敏感。这些研究结果特别是C2和C4亚型特异性hub基因的鉴定，为膀胱癌免疫治疗药物的开发提供了参考。

一.材料和方法

1.1数据预处理

从TCGA，GEO和ArrayExpress这三个平台获得BLCA数据集。从TCGA，UCSC Xena和cBioPortal 中下载了407例病例的RNA-seq数据（FPKM），varscan的变异数据和临床信息。使用Ensemble数据库进行基因注释。从ArrayExpress数据库下载了476例早期尿路上皮癌（E-MTAB-4321）的RNA-seq和临床数据（N = 476）。GEO BLCA数据集由以下四个数据集合并而成：GSE13507（165个初级BLCA病例），GSE32548（N = 131），GSE31684（N = 93）和GSE48276（N = 116）。对四个数据集的表达数据进行了分位数归一化，并应用R中的sva包进矫正批次效应。

1.2基于免疫基因集的BLCA亚型的鉴定

通过文献检索确定了代表肿瘤免疫的29个免疫基因集。应用GSVA包得到19个免疫基因集的ssGSEA打分。根据ssGSEA打分应用ConsensusClusterPlus包进行聚类并识别亚型。根据累积分布函数（CDF）曲线的聚类分数确定最佳聚类数，并评估CDF曲线下面积的相对变化。应用主成分分析（PCA）进行降维来验证聚类的可靠性。

1.3评估BLCA中的免疫细胞浸润，肿瘤纯度和基质含量

应用ESTIMATE算法使用转录组数据推断肿瘤细胞的组成和浸润情况，并鉴定与基质细胞和免疫细胞浸润有关的特征。使用Kruskal–Wallis检验比较了每个数据集中BLCA分子亚型的差异。

1.4 BLCA分子亚型中免疫细胞亚群的比较

使用R中的CIBERSORT包来评估BLCA分子亚型之间22种免疫细胞类型的频率差异。

1.5基因共表达网络分析

为了研究特征免疫基因在BLCA各分子亚型中的分布，并识别与免疫细胞浸润高度相关的基因或基因模块，利用R包WGCNA对来自IMMPORT的1671个由表达矩阵组成的免疫相关基因的数据进行了评估。构建了WGCNA网络并应用Cytoscape 3.7.1进行了可视化。

1.6基因集富集分析（GSEA）

使用c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt作为参考基因集，将在所有三个数据集中分类为C2和C4亚型的样本的表达矩阵进行GSEA分析。

1.7免疫和化学反应预测

应用TCGA的FPKM RNA-seq表达谱结合子类定位方法预测BLCA免疫亚型对免疫检查点阻断的临床反应。基于最大的药物基因组学数据库，预测了每个样本的化疗反应。选择了四种常用药物：顺铂，阿霉素，吉西他滨和博来霉素。使用R包“prropathic”进行预测，其中使用岭回归估计样本的半数最大抑制浓度IC50，并根据GDSC训练集使用10倍交叉验证来评估预测的准确性。

二.结果展示

2.1 基于免疫基因集的BLCA亚型的鉴定

对29个免疫相关基因集进行ssGSEA分析，得到每个样本中基因集的分数。使用R包ConsensusClusterPlus将所有肿瘤样本分为k个亚型，并根据CDF曲线的共识得分，k = 4为最佳。此外，PCA显示，基于29个免疫基因集的ssGSEA评分可以分为四个亚型（称为C1-C4；图1A-D）。免疫浸润程度按以下顺序降低：C2> C1> C3> C4。使用GEO和ArrayExpress验证集获得了一致的结果。

图1.BLCA TCGA队列的一致性聚类

2.2 四种免疫亚型的免疫特性

Thorsson等人基于五个核心模块的免疫表达特征定义了TCGA中的33种非血液系统肿瘤类型。应用三个跨平台数据集，获得了四个稳定的免疫亚型，其中C2的渗透程度最高，其次是C1，C3和C4。特别是，C4表现出一种“沙漠”样表型（图1E）。这与作者基于29个免疫基因集的ssGSEA聚类分析结果一致，表明大多数免疫集的浸润程度按以下顺序降低：C2> C1> C3> C4（图2A，3A，4A）。然后作者应用ESTIMATE评估了四种亚型的基质评分，免疫评分和肿瘤纯度。结果发现C2的基质和免疫评分最高，C4的基质和免疫评分最低（C2> C1> C3> C4）。相反，C2具有最低的肿瘤纯度，而C4具有最高的肿瘤纯度（C4> C3> C1> C2）（图2B–D，3B–D，4B–D）。最后，作者检查了与免疫逃逸相关的六个免疫检查点基因的表达。结果显示基因的表达水平按以下顺序下降：C2> C1> C3> C4（图2E–J，3E–J，4E–J）。

图2. 在BLCA TCGA队列中鉴定了四种免疫亚型

图3. BLCA GEO队列中四种免疫亚型的鉴定

图4. BLCA ArrayExpress队列中四种免疫亚型的鉴定

2.3 四种免疫亚型的临床特征

为了探索免疫分型与常见临床特征之间的关联，作者分析了TCGA队列中的性别，年龄，等级，病理亚型，T期，M期，N期，种族，淋巴管浸润和转移（表1）。在ArrayExpress验证队列（表2）中，只有等级和病理亚型在免疫类型之间显示出显著差异。

表1. TCGA队列中四种免疫亚型与临床特征之间的相关性

表2. ArrayExpress队列中四种免疫亚型与临床特征之间的相关性

2.4 四种免疫亚型的预后意义

在这一部分，作者根据免疫基因集的ssGSEA评分对四种亚型进行预后分析。在TCGA队列中，C2亚型的OS，RFS和PFS最佳，表明高免疫浸润有益于BLCA的生存。在GEO验证队列中，C2和C3的OS最好，而C4的OS最差（图5）。

图5.四个亚型的生存分析

2.5 使用CIBERSORT比较四种亚型中的22种免疫细胞

为了比较这四种亚型在人类免疫细胞亚群中的差异分布，作者采用CIBERSORT算法，以p<0.05为阈值，计算出每个亚型的3个数据集中22个免疫细胞群体的含量。作者还对tcga队列中的22种免疫细胞类型进行了相关性和生存分析（图6）。其中cd8t细胞，cd4记忆激活t细胞，滤泡辅助性t细胞，m0巨噬细胞，m2巨噬细胞和中性粒细胞在blca中具有预后意义。

图6. CIBERSORT算法在22例人体免疫细胞中的分布差异及预后意义

2.6 免疫亚型对免疫/化学疗法敏感性的差异

随着免疫检查点抑制剂作为BLCA的常规药物的批准，可以进一步研究免疫疗法的可能性。在这一部分，作者使用亚类映射来比较这四种免疫亚型的表达谱与一个包含47名对免疫治疗有反应的黑色素瘤患者的数据集中的表达谱。作者发现C2亚型比其他亚型对抗PD-1治疗更敏感。作者选择了四种具有代表性的化学药物作为研究对象来评价四种免疫亚型的反应。应用岭回归方法对GDSC细胞系数据集进行预测模型训练，并用10倍交叉验证法评估了比较高的预测精度。基于这四种化学药物的预测模型，估计了TCGA数据集中每个样本的IC50。对于顺铂和阿霉素，C2最不敏感，C4最敏感。对于博莱霉素和吉西他滨，C2最敏感，C4最不敏感（图7）。

图7. 免疫亚型对免疫/化疗敏感性的差异

2.7 基因集富集分析

为了研究与每种亚型相关的生物学变化，作者对C2和C4亚型进行的GSEA分析。C2亚型富集与细胞凋亡，JAK-STAT信号通路，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，粘着斑和细胞粘附分子有关的基因，这些结果已使用GEO和ArrayExpress数据集进行了验证。C4亚型富集了参与代谢通路相关的基因，但并不明显（图8）。

图8.基因集富集分析

2.8 GSEA鉴定的免疫亚型相关通路的体细胞突变景观

为了研究BLCA亚型相关通路的体细胞突变频率是否存在差异，以及观察BLCA亚型的不同突变模式，对TCGA数据库中的体细胞突变数据进行了分析。图9显示了在MAPK信号传导通路，细胞凋亡通路，JAK-STAT信号传导通路以及粘着粘附和细胞粘附分子中具有高突变频率的基因。C3和C4的FGFR3突变频率远高于C1和C2。凋亡相关基因PIK3CA的突变频率在C4中显著低于C1，C2和C3。EP300是JAK-STAT信号转导通路的核心基因之一，在C4中的突变频率明显低于C1，C2和C3。另外，C3中的ERBB2突变频率显著低于C1，C2和C4。

图9. 在TCGA队列中C1-C4中由GSEA识别的免疫亚型相关通路的体细胞突变景观

2.9 BLCA亚型与间质和干细胞特征的相关性

在这一部分，作者研究了基质和干细胞浸润，因为除了免疫评分外，BLCA的免疫亚型间质评分也有显著差异。应用ssGSEA算法计算四个基质成分和八种干细胞类型的丰度（图10）。C2亚型与其它3个亚型（包括4个基质成分和7个干细胞群体）之间存在显著差异，C2亚型显著高于C1、C3和C4亚型。此外，C3和C4中诱导多能干细胞（iPSC）的丰度显著高于C1和C2（图10）。

图10. BLCA亚型与基质和干细胞特征的相关性

2.10 四种亚型的基因共表达网络分析

为了进一步确定BLCA免疫分型的特征性标记基因，作者从IMMPORT数据库中下载了1,671个免疫基因用于基因共表达网络分析（WGCNA），并获得了八个基因模块。图11中以黄色和黑色显示的两个模块与C2正相关，与C1，C3和C4负相关。SH2D1A，PDCD1，LCP2和TRAC与大多数免疫基因组负相关，而TRVB28，HLA-DRA，HLA-DMB，CD8A，CD3E，CD3G和CCR5与大多数免疫基因组正相关（图11）。

图11. TCGA队列中1,671个免疫基因的共表达分析

生存分析显示，除LCP2外，所有基因的高水平预示着BLCA的预后良好（图12）。

图12.hub 基因生存分析

好啦，这篇文章的内容就这么多啦~总之，基于免疫基因集的BLCA免疫分型清楚地描述了不同BLCA免疫微环境的异质性，反映了免疫分型的敏感性。免疫微环境对BLCA的发生和发展有重要影响。不同免疫相关方法的验证可以为BLCA以及其他癌症提供临床决策。相比一般的免疫基因集预后区别在于使用他们的ssGSEA得分（功能层面）进行聚类，而不是基因表达，分析了不同亚型间的差异：临床特征、免疫浸润、预后、免疫治疗、化疗、突变、干性特征等，最终还构建共表达网络筛选疾病marker，内容丰富，逻辑性强比较值得借鉴。

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肿瘤免疫分型这么分析更靓 #419

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