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11 months ago 组学分析不要再沉迷铁死亡、铜死亡、自噬等老掉牙热点啦！郑州大学这篇IF 7+生信结果告诉你：什么是现在的热点主流！ by i生信
本期分享一篇通过结合单细胞和bulk数据、基于细胞衰老特征建立的肾透明细胞癌预后模型，本文发现了肿瘤微环境内细胞衰老相关通路的异常，基于异常通路中的基因构建细胞衰老相关亚型和风险模型，并将免疫治疗的效果与细胞衰老相关的风险评分联系起来。
文章于2023年7月发表于《Frontiers in Immunology》，通讯作者为厦门大学/郑州大学的Fahui Liu研究员和瑞典哥德堡大学/郑州大学的Jikui Guan助理教授，标题“Integrating scRNA and bulk-RNA sequencing develops a cell senescence signature for analyzing tumor heterogeneity in clear cell renal cell carcinoma”（IF 7.3）。
文章链接：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2023.1199002/full
1、本文基于公共数据库中单细胞测序数据和自测的bulk RNA-seq数据，挖掘了细胞衰老的基因特征。
2、本文提供了有良好预测性能的预后模型，可用于生存预测和免疫治疗效果预测。
肾细胞癌(RCC)是由肾上皮细胞分化而来的最典型的肾脏恶性肿瘤。肾癌患者的五年总生存率(OS)低于20%。肾透明细胞癌(Clear cell RCC，ccRCC)是最常见的组织学亚型，约占RCC的70%，手术切除是其治疗的首选方法，但容易复发。
ccRCC的发病机制受肿瘤微环境(TME)的影响，TME包括恶性肿瘤细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)、CD8+T细胞和成纤维细胞。目前，已有一些生物标记物被用于建立评估ccRCC风险模型，但这些模型的应用价值仍然不足。
因此，开发一种新的基于ccRCC重要基因和通路的预测模型是至关重要的。
1、基于单细胞公共数据探索细胞衰老特征；
2、GSEA分析bulk RNA-seq数据集中肿瘤细胞衰老相关途径；
3、基于筛选出的基因构建细胞衰老相关亚型和风险模型；
4、验证所建立模型的准确性，并将其与免疫治疗的效果联系起来。
在单细胞水平上探索细胞衰老特征
作者从GEO数据库中收集14个样本的信息，分析7个亚群在每个样本中的百分比。使用CopyKat预测单细胞数据中细胞的CNV变化，以区分每个样本中的肿瘤细胞和正常细胞（图1）。
功能富集结果显示，成纤维细胞衰老相关通路在恶性细胞中的得分高于非恶性细胞，内皮细胞仅存在于非恶性细胞中（图2）。
图1：肾透明细胞癌的单细胞图谱
图2：单细胞水平上基于GSVA的衰老相关通路的差异分析
基于bulk RNA-seq数据对细胞衰老异常特征进行验证
作者使用bulk RNA-seq检测了肿瘤和正常组织样本中的基因表达谱。
GSEA分析显示REGULATION_OF_CELL_AGING、NEGATIVE_REGULATION_O-F_CELL_AGING和P53_SIGNALING信号通路在肿瘤组织中显著富集。
ssGSEA分析显示，REGULATION_OF_CELL_AGING、NEGATIVE_REGULATIO-N_OF_CELL_AGING和P53_SIGNALING信号通路在肿瘤组织中的富集分数高于癌旁组织（图3）。
图3：TCGA数据集中衰老相关途径的富集结果
基于生信分析，构建细胞衰老相关亚型
对上述三条通路的基因进行单因素Cox分析， TCGA数据集、ICGC数据集中分别有57个、18个与预后相关的基因，有7个同时在两个数据集中的基因。
对TCGA数据集中的526个ccRCC样本进行聚类分析，设定k=3，可获得三个亚型，三个亚型在预后上有显著差异（图4）。
图4：ccRCC衰老相关亚型的鉴定
细胞衰老相关亚型的临床表型和基因变异的差异
TCGA数据集中的患者，其性别、T分期、N分期、肿瘤总分期、分级和生存状况方面，在三个亚型之间存在显著差异（图5）。
使用mafTools软件包分析单核苷酸变异(SNV)数据，从中选择变异最多的前15个基因并进行可视化（图6）。
图5：TCGA数据集中三种亚型不同临床特征分布的比较
图6：不同亚型间拷贝数差异图谱
不同细胞衰老相关亚型的生物学特性
使用ssGSEA计算来自TCGA数据集的每个样本的CCP得分（细胞周期进展相关评分，较高者说明细胞分裂、增殖较快）， 预后最差的Clust3亚型具有较高的CCP评分。使用CiberSort对TCGA数据集中的22个免疫细胞进行评分，发现一些免疫细胞（特别是巨噬细胞）在不同的衰老亚群中的水平表现出显著差异。
对来自TCGA-KIRC的样本中的10条肿瘤相关途径进行了富集分析，均观察到显著差异（图7）。
图7：从TCGA数据集比较不同年龄亚型ccRCC的生物学特性
细胞衰老相关风险模型的构建与验证
使用limma包进行差异分析，得到一系列差异基因。通过轨迹分析等方法进行筛选，最终保留10个差异基因，建立Senescore计算公式。
对模型中涉及到的基因DUSP1（编码一种双特异性磷酸酶，在减数分裂细胞周期期间调节其活性，在各种人类癌症中，观察到DUSP1的异常表达与肿瘤患者的预后有关），本研究进一步探究了其与细胞衰老之间的关系，即用Si-RNA沉默786-O细胞中DUSP1的表达。结果提示DUSP1基因敲除抑制了786-O细胞的衰老，有力地说明了筛选出的差异基因与衰老之间存在较强关联（图8）。
图8：风险模型的构建及关键基因的功能验证
风险模型的预测性分析与验证
图9：风险模型的预后分析和验证
风险模型与临床特征的相关性研究
作者分析了TCGA-KIRC数据集中不同TNM分级和分期的RiskScore的差异，发现临床分级越高，风险评分越高(图10)。
图10：TCGA数据集中临床病理特征的差异
细胞衰老风险评分治疗预测效果及药物敏感相关性
使用Hmisc程序包分析细胞周期、端粒酶延长、缺氧、血管生成和免疫与细胞衰老相关风险分数的相关性（图11）。
Senescore高的ICB治疗患者不太容易从免疫治疗中受益（图12）。比较高危人群和低风险人群对常规化疗药物的反应，发现高Senescore组表现出更高的敏感性(图13)。
图11：Senescore和生物学特征得分之间的关联
图12：Senescore在免疫治疗中的应用
图13：Senescore与IC50药物敏感性的差异分析
结合Senescore与临床病理特征，完善预后模型
单因素和多因素Cox回归分析将Senescore确定为最显著的预后因素。
建立列线图，发现Senescore对生存预测的影响最大。
运用决策曲线分析(DCA)对该模型的可靠性进行评价，列线图和Senescore显示出较好的生存预测能力（图14）。
图14：Senescore的临床应用
基于单细胞数据分析，本文解释了TME内细胞衰老相关通路的异常。同时，本文通过GSEA筛选了bulk RNA-seq数据集中肿瘤组织中的细胞衰老相关途径，并基于这些途径中的基因构建了细胞衰老相关亚型和风险模型。此外，本文还将免疫治疗的效果与细胞衰老相关的风险评分联系起来。
本文中所探索的基因表达特征难以推广到其他类型的肿瘤，因为每种肿瘤类型都有不同的生物学和遗传学特征，这可能会影响肿瘤细胞中衰老标志物的表达。
本文使用的数据来自有限的数据集，可能不能完全代表整个ccRCC患者群体的特征。
同时，没有考虑潜在的外部因素（如环境因素和生活方式）对结论的影响。如能使用更多肿瘤类型、纳入更多外部因素的数据集进行分析，则研究的科学性和完整性可以更好。
在书写国自然标书时，我们可以借鉴本文的选题方法，即基于某个较具体的疾病（如肾透明细胞癌），选用较广泛的生信技术数据库（如结合普通转录组和单细胞数据）进行引入，以凸显临床问题的重要性、选取靶点依据的科学性。在机制研究的基础上，建立有效实用的临床预后模型，推动临床转化，使标书课题升华至新的高度。
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