ixxmu
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9 months ago 大样品量的传统bulk转录组解决方案 by 生信技能树
先抛出一个问题给大家：单细胞转录组就一定是比传统的bulk转录组贵吗？
转录组成本问题
传统bulk转录组测序项目大家都很熟悉了，我们的明码标价之转录组常规测序服务（仅需799每个样品） 和 明码标价之普通转录组上游分析 可以帮助大家快速拿到表达量矩阵，而明码标价之转录组下游分析仅需800元 又可以进行最起码的差异分析，富集分析，以及各种各样的可视化。
因为现阶段传统bulk转录组测序项目成为了标准品，无论大家在哪个公司测序都是几百块钱一个样品，简单的3分组的6个样品，就包括了定量和普通差异分析富集分析的服务，因为都是流程化的。随着国产华大基因的测序服务的崛起，以及illumina的更新换代，测序成本一降再降。2021的时候还是：明码标价之转录组常规测序服务（仅需799每个样品） ，到2022就是常规转录组测序加分析仅需549，12个样品起。
价格：¥549/sample（如果需要建库服务每个样品加收50元）
策略及平台：PE150，6G数据量（上下浮动10%），MGIseq2000平台。（如果一定要选择illumina平台加60元）
一些特色增值服务：
1.免费提供基于数据结果的项目再次优化。
2.样本量大于12个客户，免费赠送16小时转录组分析全套视频 (Linux系统操作、R语言绘图、转录组分析)及针对视频的1年服务器练习使用权限。
虽然已经是超级亲民的价格，但是仅限于简单的3分组的6个样品，或者多分组但是十几个样品这样的数据量。一般来说，差异分析流程适用于两两比较，简单的格式，但实际科研中往往不是这样，比如 ：GSE116439 数据集：
Drug-induced change in gene expression across NCI-60 cell lines after exposure to 15 anticancer agents for 2, 6 and 24h (cisplatin)，详见：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE116439
其中一个细胞系的一种药物的不同浓度不同时间段处理数据如下：
GSM3232817 MDA-MB-231_cisplatin_0nM_24h
GSM3232818 MDA-MB-231_cisplatin_0nM_2h
GSM3232819 MDA-MB-231_cisplatin_0nM_6h
GSM3232820 MDA-MB-231_cisplatin_15000nM_24h
GSM3232821 MDA-MB-231_cisplatin_15000nM_2h
GSM3232822 MDA-MB-231_cisplatin_15000nM_6h
GSM3232823 MDA-MB-231_cisplatin_3000nM_24h
GSM3232824 MDA-MB-231_cisplatin_3000nM_2h
GSM3232825 MDA-MB-231_cisplatin_3000nM_6h
这里面有60个不同细胞系，15种不同的药物，设计了3种不同的浓度梯度，处理后的不同时间段连续取样。如下所示的药物：
这么多样品如果是都做转录组，成本就上来了。而且这样的实验也不在少数，经费充足的大课题组总是存在的。
单细胞转录组其实也两个方向
Smart-seq2和10x这两个单细胞技术是现在初学者进入单细胞领域最需要掌握的，它们代表着单细胞的两个全然不同的发展策略。绝大部分的单细胞技术原理介绍会从 单细胞悬浮液制备到测序细节面面俱到，其实并不那么的初学者友好，最近有粉丝在公众号后台留言说他们的博士课程有一个思考题是：简要概述smart-seq2和10x技术的单细胞差异。然后他给大家推荐了一个高度精炼的综述，这个综述于2020年9月发表在 《Experimental & Molecular Medicine》杂志，标题是：《Single-cell sequencing techniques from individual to multiomics analyses》，链接是：https://www.nature.com/articles/s12276-020-00499-2
可以看到这个综述总结了smart-seq2和10x技术的5大差异
smart-seq2技术依赖于C1这个仪器，每次都是96个细胞一起测序，每个细胞的测序量这个综述可能是写错了，应该是1M-10M为佳，不太可能是100-1000个M，最重要的是它是整个RNA分子的全长测序，每个细胞都是独立的测序。
但是10X呢，每次可以测好几千的细胞，每个细胞只需要5-10K的reads，而且仅仅是测RNA分子的一段即可，全部的细胞都混合在一起，虽然说有barcode可以区分。
现在比较成熟的10X单细胞转录组每个样品制备后比较理想的说测8000多个细胞，其实就相对于是8000多个转录组样品，只不过是每个样品仅仅是测序了50K的reads，而我们常规的bulk转录组每个样品是20M的转录组，400倍的测序数据量差异。
如果我们想测8000个常规bulk转录组，哪怕是做到单价100块钱，也是80万人民币，不是一般的课题组能承受的。其实这个时候往往是样品更珍贵的了，比如大名鼎鼎的TCGA计划确实是33种癌症好几万的常规bulk转录组但是耗资很可观而且持续十好几年。
因为大家研究的问题不一样，所以很难下结论说单细胞转录组就一定是比传统的bulk转录组贵，而且smart-seq单细胞技术产出的单细胞转录组数据基本上跟传统的bulk转录数据有类似的数据处理流程。
把smart-seq单细胞技术应用到大样品量的传统转录组
如果因为课题需要，必须得做大样品量的传统的bulk转录数据，这个时候可以把smart-seq单细胞技术应用起来，比如数据集：GSE164788，对应的文章是：Machine learning identifies candidates for drug repurposing in Alzheimer's disease. Nat Commun 2021 Feb ， PMID: 33589615，数据集链接是：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE164788
可以看到这个是 764 个样品，做了 80 FDA-approved and clinically tested drugs in neural cell cultures：
GSM5018704 dge1_A01 RNA-seq of ReNcell VM treated with 0.3 uM bx-912
GSM5018705 dge1_A02 RNA-seq of ReNcell VM treated with 10 uM hg-9-91-01
GSM5018706 dge1_A03 RNA-seq of ReNcell VM treated with 0.3 uM pha-665752
并且给出来了的矩阵并不是常规的行是基因列是样品的矩阵 ：
GSE164788_deduplicated_counts.csv.gz 32.5 Mb
GSE164788_normalized_counts.csv.gz 51.6 Mb
所以我去看了看原文，是 High-throughput profiling using 3′ DGE 技术，使用了 384-well PCR plate;这样的话每个孔的样品都有唯一的well barcodes and unique molecular identifiers (UMIs) ，这样的话每个384孔板可以混合去测序并且定量，最后表达量矩阵按照每个样品的UMI拆分即可。也就是说，看起来是这个GSE164788是764 个bulk转录数据样品，但是实际上就两次转录组测序即可。
那么， 好问题来了，这个技术的商业化如何？
https://mp.weixin.qq.com/s/Rv0QDcs5j4ssn5q3w5Cz7Q