癌症化疗耐药怎么破？从TET1找找着手点

癌症化疗耐药怎么破？从TET1找找着手点 by 嘉因生物

化疗耐药是延长胰腺导管腺癌(PDAC)患者生存的主要障碍。TET1被认为是促进癌症化疗耐药的最重要的表观遗传修饰酶。然而，TET1在PDAC中的耐药机制尚不清楚。本研究旨在探讨TET1在PDAC耐药中的作用，研究TET1对PDAC的体内外耐药情况。

应用组织芯片技术分析TET1在228例PDAC患者中的临床意义。我们发现TET1的下调是由其启动子的超甲基化引起的，并与PDAC患者的低生存率相关。通过沉默或过表达TET1进行的体外和体内功能研究表明，TET1能够抑制上皮间充质转化(EMT)，并能增强PDAC细胞对5FU和吉西他滨的敏感性。RNA-seq、全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)和ChIP-seq分析表明，TET1通过结合和去甲基化CHL1启动子促进CHL1转录，从而抑制Hedgehog途径。此外，用CHL1过表达或Hedgehog途径抑制剂GDC-0449抑制Hedgehog信号，可逆转TET1沉默诱导的化疗耐药。在临床意义方面，我们发现在可切除的PDAC患者中，TET1和CHL1的高表达预示着较好的预后。

通过启动子高甲基化，TET1在PDAC中的表达下调

为了确定TET1在PDAC中的临床意义，我们首先分别通过RT-PCR和western blot检测PDAC患者TET1 的mRNA和蛋白水平。与邻近的正常胰腺组织相比，肿瘤组织TET1的mRNA和蛋白水平较低。在PDAC组织中，我们通过亚硫酸氢盐测序PCR (bisulfite sequencing PCR, BSP)分析了TET1启动子的甲基化情况，发现与正常胰腺组织相比，PDAC组织中的TET1启动子高度甲基化(图1e)。

综上所述，这些结果表明，TET1在PDAC组织中显著下调。

图1

消除TET1表达增加胰腺癌细胞对GEM和5FU的抵抗

研究TET1在PDAC中的生物学功能。GEM和5FU是PDAC常用的化疗药物，我们发现TET1敲低显著降低了PATU8988细胞（过表达TET1）对GEM和5FU的敏感性，TET1过表达增加PANC-1细胞（TET1低表达）对GEM和5FU的敏感性。

我们观察到，在PDAC细胞中过表达TET1增加了上皮标志物(E-cadherin)的表达，而降低了PANC -1细胞中间充质标志物(Vimentin， N-cadherin, 和 Snail))的表达。

这些数据均表明，TET1过表达增加了PDAC在体内外对化疗的敏感性。

图2

TET1通过去甲基化CHL1启动子来上调CHL1表达

我们通过RNAseq来鉴定TET1敲低影响的转录组改变，发现TET1敲低降低了许多化学反应相关基因的表达(图3a)。ChIP-seq数据结果表明，TET1被富集CHL1启动子上的CpG岛(图3e)。通过TET1的ChIP实验观察到TET1是结合到CHL1启动子区域的site-2位点（图3f）。这些结果提示TET1可以通过与CHL1启动子结合直接上调CHL1表达。我们还分析了甲基化图谱，发现当TET1在小鼠胚胎干细胞中被删除时，CHL1启动子表现出了超甲基化状态(图3i)。

综上所述，这些结果表明TET1上调通过直接结合CHL1启动子并去甲基化CHL1表达。

图3

TET1低表达通过CHL1-Hedgehog信号通路促进PDAC细胞对化疗的耐药

结果发现CHL1在PATU8988/5FU细胞中的表达明显低于亲本细胞(图4A)，CHL1在PATU8988/5FU细胞中的过表达增加了PATU8988/5FU细胞对5FU的敏感性(图4B)。另外，沉默CHL1表达消除了由TET1过表达引起的PDAC细胞对GEM的敏感性(图4C)。此外，CHL1的过表达逆转了由低TET1表达引起的PDAC细胞对GEM的抗性(图4C)。

这些结果表明，TET1参与PDAC化疗耐药依赖于CHL1的表达。

我们进一步研究了TET1/CHL1轴调控的PDAC化疗耐药的潜在生物学途径。我们对表达靶向对照或CHL1 shRNA的PATU8988细胞进行了RNA-seq，基因集富集分析(GSEA)表明，当CHL1被击倒时，Hedgehog信号通路显著富集(图4D)。

以上结果表明，TET1/CHL1轴调控CHL1- hedgehog信号通路。

图4

l 抑制Hedgehog信号通路逆转TET1沉默诱导的PDAC化疗耐药

图5A中发现Hedgehog信号通路的抑制逆转了TET1基因敲除引起的PDAC细胞对GEM的耐药性。与对照组相比，Hedgehog抑制剂GDC-0449加GEM治疗显著延长了小鼠的存活时间(图5B)。此外，在转染shTET1的PATU8988细胞皮下肿瘤模型中，GDC-0449和GEM联合使用比单独使用GDC-0449或GDC-0449更有效地抑制PDAC肿瘤的生长(图5C-E)。

以上结果表明，TET1通过CHL1-Hedgehog信号通路调控化疗耐药性，抑制Hedgehog信号通路可能对TET1低表达的PDAC患者有益。

图5

TET1和CHL1与PDAC患者不良的RFS和化疗耐药预后相关

在肿瘤中CHL1低表达的患者比CHL1高表达的患者有更短的OS和RF(分别为P<0.001和P<0.001)(图6A，B)。联合检测TET1和CHL1水平可以更好地预测术后接受GEM辅助治疗的PDAC患者的化疗预后。

这些发现表明，这两个变量的结合可以改善PDAC患者预后的预测。

图6

总结

本研究首次报道了TET1在PDAC中的耐药机制，加深了对PDAC中TET1/CHL1/Hedgehog信号通路的理解。然而，CHL1抑制Hedgehog途径的机制尚不完全清楚。根据PDAC组织中TET1和CHL1的表达，确定术后对化疗药物的耐药性还需要进一步的临床试验。总之，我们的数据强调了TET1在PDAC细胞的化疗耐药中所起的关键作用(图7)。这些数据还表明，TET1和CHL1的结合可能成为预测PDAC患者不良预后的新的生物标志物。

图7

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癌症化疗耐药怎么破？从TET1找找着手点 #462

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