文章发表: CTM｜T细胞代谢重编程和抗肿瘤免疫

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文章发表: CTM｜T细胞代谢重编程和抗肿瘤免疫 by 珠江肿瘤

Hello大家好，今天与大家分享我们课题组近期在Clinical and Translational Medicine（IF=10.6）上发表的一篇Review，名字为“解锁T细胞代谢重编程的潜力:推进单细胞方法在肿瘤免疫精准免疫治疗中的应用”。

Graphical Abstract：

1.单细胞RNA测序已成为阐明细胞亚型和代谢异质性的主流优质工具

2.肿瘤微环境中T细胞内代谢途径相互协调的，导致T细胞行为的多样性。

3.对T细胞代谢和免疫功能相互作用的相关机制洞悉可为精准化免疫治疗方法提供线索

 

Abstract：

单细胞RNA测序技术能够对T细胞亚群进行详细聚类，并有助于分析T细胞的代谢状态和代谢物动态，因此它已成为理解细胞代谢异质性的首选工具。此外，肿瘤微环境中T细胞内各种代谢途径的协同或抑制作用是协调的，特定代谢途径活性的增加通常与功能活性的增加相对应，导致与肿瘤免疫细胞效应相关的多样性T细胞行为，这表明肿瘤特异性T细胞具有诱导持久免疫应答的潜力。全面了解代谢异质性如何调控特定T细胞亚群的免疫功能，是在免疫代谢领域获得全局性洞见的关键。因此，探索T细胞代谢与免疫功能相互作用的基础机制，将为未来精准免疫治疗方法铺平道路，这将使我们能够探索更有效抗击肿瘤的新方法。

1.Introduction

T细胞是适应性免疫系统的重要组成部分，被认为可以保护宿主免受肿瘤抗原入侵。此外，由于T细胞受体(TCR)抗原识别和表型的差异、肿瘤微环境(TME)中各种细胞因子或代谢产物的影响，以及肿瘤细胞对免疫细胞的选择性作用等因素，T细胞对肿瘤抗原的应答表现出很大的可变性，这取决于它们的不同分化亚型和阶段。慢性抗原刺激的CD8⁺ T淋巴细胞表达高水平的免疫抑制性受体，常处于耗竭状态，导致免疫效力降低和细胞增殖能力下降。CD4⁺ T细胞分化产生调节性T细胞(Tregs)，这是一种免疫抑制性淋巴细胞，被招募到微环境中以促进肿瘤细胞逃避免疫监视。此外，肿瘤浸润T细胞(TILs)的分化状态和特定功能与T细胞的合成代谢和能量代谢有关。T细胞在激活后会根据环境的变化和自身的需求进行代谢重塑，通过多条途径介导T细胞免疫。例如，效应T细胞(Teffs)主要依赖有氧糖酵解来支持其抗肿瘤活性。然而，在缺乏葡萄糖的TME中，Teff糖酵解减少，产生的三磷酸腺苷(ATP)和代谢中间产物不足，导致大多数CD8⁺ T细胞功能障碍或耗竭。此外，在缺氧的TME中，T细胞耗竭标志物的产生通常与线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)的减少有关。脂肪酸合成促进CD4⁺ T细胞向辅助T细胞(Th)分化。然而，Tregs通过激活转录因子Foxp3，将产能代谢途径转向脂肪酸氧化(FAO)和OXPHOS，以适应富含乳酸和脂肪酸的微环境，从而增强自身浸润并帮助肿瘤细胞逃避免疫监视。此外，T细胞中的氨基酸代谢可能会改变表观遗传修饰，导致T细胞功能发生改变。当葡萄糖浓度低时，T细胞可以代谢谷氨酰胺产生S-2-羟基戊二酸(S-2HG)，可能改变组蛋白和DNA去甲基化速率，并重新编程耗竭T细胞(Texs)中的抗肿瘤免疫应答机制。此外，TME中细胞的高代谢消耗了T细胞中的蛋氨酸，这有助于Teff组蛋白甲基化并损害Teff免疫功能。在T细胞亚群之间观察到了显著的变异性，亚群间的相似性和差异通常通过质谱流式细胞术(CyTOF)和流式细胞术在单细胞和蛋白表达水平上进行检测。CyTOF可以对细胞代谢物丰度进行批量分析，但仍然缺乏分离和定义单个T细胞表型的能力。与流式细胞术和单细胞测序相比，CyTOF依赖于严格的抗体标记和通量较低的单细胞制备工作流程。此外，传统的流式细胞术分析可以根据表面标志物或分子来鉴定T细胞亚群。然而，它提供的内部遗传和动态实时信息有限，无法支持对TME中异质性和复杂T细胞亚群进行精细分选或全面分析。为了突破探索细胞异质性的界限，单细胞测序正日益成为一种更准确揭示不同T细胞亚群代谢变异的手段，并成为深入临床研究和治疗研究的可选技术。

单细胞测序可用于获取单个细胞的DNA和RNA遗传信息，即使细胞信息表现出低异质性。特别是单细胞RNA测序(scRNA-seq)可用于测量样本间基因表达的变化。此外，可以根据从scRNA-seq数据中挖掘出的细胞表达模式的相似性和异质性重建细胞发育过程中涉及的动态通路，并检测异常的T细胞亚型及其分化状态。具体而言，基于scRNA-seq的不同代谢途径的发现揭示了异常脂质累积诱导Teffs耗竭，导致Teffs和Texs中脂质代谢水平较高。此外，GADD45β ⁺ LAG3 ⁺ γδT细胞表现出增强的谷氨酰胺代谢以维持生存，但代价是降低了细胞保护分子的表达。关于代谢状态如何影响免疫活性，目前仍存在争议。值得注意的是，学者们提出根据通过scRNA-seq分析确定的T细胞亚群代谢变异，结合代谢调节剂以提高肿瘤治疗效果。例如， JHU083通过作为谷氨酰胺酶抑制剂(Gl)拮抗谷氨酰胺代谢，在Teffs和Th1细胞中驱动OXPHOS，并促进Teffs和效应记忆样T细胞的扩增，从而抑制Treg免疫抑制。

目前缺乏使用scRNA-seq来表征T细胞代谢和代谢相关免疫功能的系统综述。在本文中，我们回顾了基于单细胞测序的技术，用于阐明外周循环和TME中不同T细胞亚群的分类和T细胞的各种代谢重编程特征(Figure 1)，总结了影响T细胞代谢的因素，并解释了T细胞代谢如何直接或间接影响抗肿瘤免疫。此外，更可靠的T细胞代谢研究为免疫治疗无效提供了合理解释，并通过T细胞代谢调节通路对免疫治疗产生积极的协同作用，揭示了治疗前景。

Figure 1：具有差异表达基因的各种T细胞的特定代谢状态。根据原始表面抗原分类,支持T细胞亚群之间和内部差异性免疫活性的代谢特征通过单细胞转录组测序所显示的特异性表达标记基因被精确和微观地刻画。（红色:高表达/阳性特异性标记;黑色:低表达/阴性特异性标记;粉色:上调代谢通路;灰色:下调代谢通路。）

2. T细胞代谢重编程及相关抗肿瘤免疫功能

2.1 循环T淋巴细胞

2.1.1 与TILs相关的循环应答性T细胞代谢对调节抗肿瘤免疫至关重要

肿瘤患者的外周免疫系统是TME中局部免疫应答的基础。外周循环T淋巴细胞与TILs在肿瘤抗原激活后的通讯对于抵抗肿瘤入侵至关重要。初始T淋巴细胞(Tns)成熟后主要分散在外周循环中，在进入继发淋巴组织时被肿瘤抗原激活。在共刺激因子和细胞因子的促进下，激活的T细胞发生克隆扩增、增殖和分化，并迁移到非淋巴病变部位。Teffs可以在肿瘤发生早期穿过继发淋巴组织，但有时在非淋巴病变中，这些细胞驻留、局部分化，不再重新进入外周循环。当失去α4β7表达时，T细胞获得在肠黏膜组织中驻留和发挥效应功能的能力。那些停止通过非淋巴组织再循环的T细胞长期驻扎在特定部位，执行免疫监视，保留记忆和效应潜能。这种定位使细胞在直接接触抗原刺激时能够立即启动防御反应。有趣的是，许多结合scRNA-seq和T细胞受体测序(TCR-seq)的研究发现，外周血Tns中的TCR序列与TILs中的相同，具有该序列的外周循环T细胞被称为循环肿瘤相关T细胞。这些是具有效应或效应记忆样表型的活化肿瘤特异性CD8⁺ T细胞，与克隆扩增的CD8⁺ T细胞相比功能障碍较小，但表现出相同的时间依赖性耗竭程度。循环肿瘤相关T细胞中糖胺聚糖降解通路高度激活，而嘌呤代谢通路低度激活。此外，糖胺聚糖的积累改变了T细胞释放的细胞因子的糖蛋白形式，异常且特异性地诱导树突状细胞与T细胞结合，间接触发T细胞死亡，促进肿瘤细胞免疫逃逸。相比之下，腺苷(ADO)积累似乎通过ADO受体部分抑制TCR信号，从而抑制T细胞成熟并降低效应细胞因子(干扰素-γ [IFN-γ]、颗粒酶B等)的迁移能力。嘌呤代谢与ADO产生相关，在T细胞与肿瘤细胞一对一相互作用期间受到抑制，有效导致致死性。因此，减少糖胺聚糖和阻碍ADO产生可以最大限度地减少抑制T细胞增殖和激活的有害代谢物的积累，从而优化T细胞免疫效能。值得注意的是，与TILs相比，外周血CD8⁺ T细胞在与CD28共刺激分子相互作用后，IL-2/STAT5信号通路激活和糖酵解活性增加，电子传递链和OXPHOS活性水平也增加。因此，共刺激分子水平的增加对于为循环T淋巴细胞提供能量以增强其抗肿瘤行为至关重要。

代谢率决定循环T细胞的存活、分化和免疫功能，影响肿瘤预后。在晚期胃癌腹膜转移患者的腹水中，研究人员发现非功能性增殖的循环T细胞数量增加，具有某些初始表型(如CCR7， TCF7， LEF1)和增殖相关基因(MK167， STMN1， PCNA)的高表达。根据对腹膜循环T细胞动态发育途径的Monocle分析，当初始CD8⁺ T细胞演变为增殖性循环T细胞时，糖酵解、脂肪酸代谢和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)代谢速率增加，其增殖率达到最大。相比之下，这些细胞诱导的细胞毒性减弱，其免疫抑制功能增强。人们推测，指导循环应答性T细胞机制和某些代谢途径的重新连接，可能是控制肿瘤进展的一个有前景的解决方案。

2.1.2 循环记忆T细胞代谢动态决定其分化状态和免疫记忆形成

肿瘤特异性循环记忆T细胞(Tm)亚群，包括中央记忆T细胞(Tcms)、干细胞记忆T细胞(Tscms)和效应记忆T细胞(Tems)，是形成永久免疫记忆的驱动力。Tcms在表型上类似于Tn细胞，它们能够迅速产生IL-2以响应TCR激活，导致大量Teffs分化产生并迁移到肿瘤部位，并增加吞噬和克隆增殖速率。Tscms被认为是Tcms的前体，部分原因在于它们是具有持久免疫力的嵌合抗原受体T细胞(CAR-Ts)的关键原材料，其转录谱更类似于Tns而非Tcms，具有更高的自我更新和细胞可塑性。Tems缺乏归巢至继发淋巴组织的能力，构成了在非淋巴组织和血流之间循环的群体，在大多数这些细胞中，效应活性可以立即诱导以拦截病原体。

Tm代谢通常以依赖FAO和OXPHOS的分解过程为特征，但不同亚群对产能途径的依赖性差异显著。根据对早期复发性肝细胞癌样本进行的CD8⁺ T细胞时序分析，分化阶段的启动主要依赖脂质和脂蛋白代谢，而发育后期的效应阶段主要由脂肪酸提供燃料，这意味着早期T细胞分化与先前激活的CD45RO⁺ Tms的基因表达表型更密切相关。除了Tm细胞亚群之间共享的代谢模式外，肿瘤抗原的存在大大增加了Tns激活过程中的核苷酸代谢，Tns分化为Tcms，导致Tcms比Tems具有更强的自我更新能力。与Tems相比，Tcms更依赖OXPHOS和FAO，芳香族氨基酸合成活性显著增加，这证实了先前的发现。这一发现还解释了为什么Tns和Tcms在暴露于缺氧条件下无法激活缺氧诱导因子1α(HIF-1α);然而，在缺氧条件下，Tems中HIF-1α的激活不受OXPHOS的限制，这些细胞通过HIF-α诱导的糖酵解获得能量。

多个代谢通讯途径破坏了Tm细胞干性-记忆-效应平衡。肿瘤免疫抑制微环境中持续的抗原刺激和炎症反应可导致CD8⁺ Tms细胞的代谢重编程，导致其分化为终末期记忆细胞;这些细胞表现出高细胞毒性但增殖能力低，Tcms和Tscms发生凋亡以促进干细胞分化。因此，Tm细胞亚群之间的协调共生被破坏。天冬酰胺对T细胞分化的影响取决于其作为雷帕霉素复合物(mTORC1)激活剂的能力，从而动态控制mTORC1并调节细胞有丝分裂纺锤体形成。然而，天冬酰胺耗竭的时间受CD8⁺ T细胞预分化阶段ASNS过表达的调控，这促使Tcm极化和早期分化，导致Tcm极化延迟并驱动T细胞向具有效应表型的T细胞分化。此外，Tscm合成依赖于代谢活性与Wnt-catenin/糖原合成酶激酶-3/mTORC1信号传导的关系。雷帕霉素或Wnt-β-catenin信号通路激活剂TWS119抑制mTORC1活性，触发CD63表达并激活脂肪酸向细胞内隔室的转运，赋予Tscms稳定的线粒体生物合成能力，诱导脂质氧化代谢活跃。同样，受损的氨基酸代谢会破坏Tm细胞氨基酸转运蛋白的稳定性，一方面减弱mTORC1信号，导致Tm细胞产生速率变慢，另一方面加速外周循环中细胞获得效应-耗竭表型(CXCR3^hiCD127^lo)，阻碍Teff分化为KLRG1^-CD127^hi前体Tm细胞(Tpms)，导致循环Tm率下降，肿瘤组织中Tm免疫应答减弱。此外，介导CD8⁺ T细胞蛋白质合成的2-脱氧葡萄糖(2-DG)影响记忆状态。用2-DG处理36小时的B16-OVA肿瘤小鼠，T细胞启动子eIF-2a磷酸化水平和未折叠蛋白反应显著降低，提高了T细胞糖酵解和ATP产生并从线粒体释放，有助于CD8⁺ T细胞分化为Tscms。

总之，上述研究表明T细胞代谢途径在循环相关Tcm表型、持久性和多功能性方面起关键作用。迄今为止，进行的为数不多的研究大多基于动物实验，因此没有研究人类TME中循环T细胞的代谢。小鼠模型在忠实复制人类TME中体现的多种抗原景观的复杂性方面的能力有限。此外，scRNA-seq能以高分辨率和真实性获取单个T细胞，甚至在多种细胞成分的动态变化中鉴定TME内的新发亚群。scRNA-seq产生的高维数据集弥补了单独使用动物模型的缺陷信息。然而，由于外周循环环境pH或营养水平而导致Tms代谢重编程，很少有scRNA-seq研究验证复发性肿瘤建立的不利环境。

2.1.3 静息T细胞所需能量依赖的代谢途径灵活转换

最初，T细胞需要高水平的OXPHOS来维持细胞生长的稳态和分化的完整性，在激活后，Teffs表现出线粒体呼吸速率降低，而糖酵解和谷氨酰胺代谢增加，以确保高效的能量供应。这一观察结果已经通过scRNA-seq数据以及内源性荧光因子的生命成像得到验证。值得注意的是，早期激活的CD8⁺ T细胞的OXPHOS速率可能会波动。CD8⁺ T细胞多胺也在激活-分化转换阶段从合成转变为分解，这增强了精氨酸合成和尿素循环活性，促进了TME中细胞的存活和记忆表型分化。此外，在人工生成的高脂环境中，未激活的T细胞有效地利用脂质作为能量来源，而Teffs表现出脂肪酸消耗和支链氨基酸合成增加，同时抑制增殖和免疫攻击。静息和激活的T细胞亚群在暴露于高脂微环境后的代谢适应表现出显著差异。

2.2 免疫炎症TME中的肿瘤浸润T淋巴细胞

通过抗原呈递激活的T细胞迁移并浸润TME，通过识别和直接接触含有肿瘤抗原的细胞、释放细胞因子或激活其他免疫细胞来杀死肿瘤细胞。基于对scRNA-seq和下游基因探索数据的普遍分析，可以根据常规表面标志(CD8、CD4)产生更精确的亚群分类。此外，可以确定不同细胞亚群的代谢动态以及这些细胞在肿瘤细胞竞争资源期间适应低氧、酸性和营养不良微环境的相关调控机制(Figure 2)。

Figure 2：肿瘤微环境(TME)中的代谢变化支持不同T细胞亚群的分化。各种T细胞亚群的代谢特性表现出趋同性和显著差异性。在TME中,癌细胞和T淋巴细胞竞争代谢资源。活化的T细胞在高代谢TME中通过低氧、过度酸化和营养缺乏而容易耗竭,它们的代谢途径被重新编程以响应周围环境的这些变化。具体而言: (1) 在肿瘤特异性抗原刺激下,αβTn细胞经历代谢重塑,伴随氧化磷酸化(OXPHOS)、脂肪酸合成和氧化上调,这可能增强效应T细胞和记忆T细胞的浸润。(2) 循环肿瘤相关T细胞依赖糖酵解和谷氨酰胺分解来维持其免疫活性。 (3) 调节性T细胞(Treg)在利用乳酸和脂肪酸作为能量来源方面具有优势,这有助于它们在TME内长期发挥免疫抑制功能。(4) 随着总体能量代谢活性降低,效应T细胞逐渐过渡到功能耗竭的T细胞。

2.2.1 CD8⁺ T细胞代谢多样性

激活的T细胞增殖需要高强度的代谢。嘌呤核苷酸形成、糖异生、有氧糖酵解和FAO是ATP合成所需的，根据公开的多肿瘤单细胞转录组测序数据的基因本体通路分析，已经确定氨基酸摄取和代谢是浸润CD8⁺ T细胞的主要代谢途径。值得注意的是，CD8⁺ T细胞特有的代谢通路糖异生诱导肿瘤细胞获得大量葡萄糖，这有助于癌细胞的可塑性，但其对CD8⁺ TILs的影响仍未知。

CD8⁺ Teff耗竭和分化轨迹中代谢模式的复杂性

Texs浸润的增加归因于分化过程中糖酵解和线粒体呼吸的异常重编程。转变为Texs的Teffs表现出细胞毒性和免疫抑制标志物的高表达以及有氧糖酵解和核苷酸代谢的上调，这可能与转换细胞释放信号分子IFN-γ和形成炎症微环境密切相关。然而，Texs表现出低葡萄糖利用率和线粒体呼吸速率。大多数能量代谢通路中关键代谢酶水平显著降低，尤其是有氧糖酵解和OXPHOS调节因子，表明T细胞处于耗竭状态，这与先前的流式细胞分选研究结果一致。慢性肿瘤抗原刺激干扰T细胞ADP偶联的OXPHOS，直接降低ATP产生并抑制DNA复制和蛋白质合成。此外，它诱导高通量葡萄糖摄取并将葡萄糖重定向到乳酸产生途径，导致糖酵解和三羧酸(TCA)循环速率降低。结果，CD8⁺ T细胞的氧耗率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)显著增加，导致这些细胞耗竭，自我更新能力降低，在某些情况下倾向于凋亡。因此，Teff稳态需要OXPHOS和糖酵解之间的动态平衡。先前的研究表明，通过单细胞多组学分析直接干扰与肿瘤发病机制相关的线粒体核糖体蛋白(CR6-相互作用因子1，CRIF1)或CRIF1-相互作用蛋白Lck，可能为TILs与线粒体蛋白功能之间的关系提供新的见解。

脂质代谢重编程在Tex分化和功能调控中发挥关键作用。CD8⁺ Texs的耗竭表型与脂肪酸合成速率增加呈正相关，表明异常加速的脂质代谢与高度功能障碍的Texs相关。然而，适当启动脂肪酸代谢对维持Teff和Tex的免疫效应至关重要。在一项早期复发性肝细胞癌的研究中，作为再分化启动因子的CD8⁺CCR6⁺ T细胞分化为细胞毒状态的中间细胞类型，经典细胞毒基因(GZMK、GZMH、GZMA)高表达，耗竭表型相关基因(PDCD1、CLTA4、HAVCR2)低表达。这种状态伴随着FAO升高，FAO是Teff功能的主要能量来源。此外，Fabp5基因表达在CD8⁺ T细胞耗竭过程中特异性增加，促进脂质摄取，更重要的是正向调节肉碱棕榈酰转移酶1a(CPT1a)活性，从而激活T细胞中的FAO。这一过程通过脂质代谢稳态的自我调节赋予Texs保护。然而，脂肪酸和胆固醇合成途径的明显激活导致脂质异常积累和脂质代谢重编程，加速效应-耗竭Tex转换和形成有助于癌细胞生长和增殖的免疫抑制微环境。通过下调胆固醇合成酶活性或调节Teffs的胆固醇摄取和外流来调节胆固醇代谢活性，可以影响浸润T细胞的肿瘤杀伤效能。

CD8⁺ T细胞分化过程中谷氨酰胺代谢受到双向调节。Tex氨基酸代谢通常受损，但谷氨酰胺代谢比CD8⁺ TIL转化过程中其他阶段更活跃。值得注意的是，与转化生长因子-β(TGF-β)信号通路激活相关的谷氨酰胺代谢显著上调，导致Texs上组织驻留标志物CD103表达减少，诱导T细胞凋亡和损伤。然而，在结直肠癌微环境中，谷氨酰胺不仅增强CD8⁺ T细胞糖酵解和乳酸代谢，而且是细胞因子合成的必需营养物质。因此，谷氨酰胺代谢平衡对维持T细胞稳定性和促进阳性分化至关重要。

脂肪酸和葡萄糖代谢协调调控组织驻留记忆T细胞活性

FAO在支持组织驻留记忆T细胞(Trms)的基本生命活动中起关键作用。Trms构成了一个Tm群体，在免疫应答的效应阶段进入受感染组织，停止在循环系统内直接参与免疫应答，但可对局部组织的再次抗原攻击进行反击。一项关于多发性骨髓瘤背景下异常代谢微环境的研究发现，CD69⁺STMN1⁺CD62L^-CD8⁺ Trm细胞相关的TCA循环活性和氨基酸代谢受损，而糖酵解和FAO增强，证实了FAO对TME内Trms介导的免疫记忆的关键作用。更重要的是，除了提供能量支持外，脂肪酸代谢还确保维持Trms中的NADPH和ATP水平，以保护它们免受活性氧(ROS)过氧化的影响。具体而言，在Trms中删除Fabp4和Fabp5会导致CD8⁺ Trms对外源游离脂肪酸的摄取减少，大大削弱这些细胞在高度代谢的TME中生存的能力。这一结果与流式细胞术分析的发现一致，即TME中的CD103^hi Trms表现出脂肪酸摄取的迅速增加，而葡萄糖利用率降低，有助于提高Trms的OCR/ECAR、备用呼吸能力(SRC)和最大呼吸能力。显然，TME内的Trms倾向于主要通过FAO来满足其基础代谢能量需求，以防止凋亡。

此外，激活的糖异生/糖原分解途径可能间接支持Trms的存活和记忆功能。肿瘤组织中浸润的CD8⁺ Tms上调磷酸烯醇丙酮酸1(Pck1)表达，增强糖异生或激活糖原分解途径，激活戊糖磷酸途径产生葡萄糖-6-磷酸用于NADPH合成，并间接产生还原型谷胱甘肽以保护Trms免受氧化应激。遗憾的是，尽管有大量证据表明浸润Tms是Trms，但仍缺乏scRNA-seq后的明确聚类研究。

旁观CD8⁺ T细胞中免疫应答二元性与代谢之间的联系

由于趋化因子或细胞因子之间的相互作用，或在外周循环或继发淋巴器官中归巢诱导迁移受体的影响下，旁观CD8⁺ T细胞，一个以CD39^-PD-1^-CD8⁺ T细胞为特征的群体，定植TME，被动扩增，缺乏与慢性刺激T细胞相关的特征。对scRNA-seq和TCR表达数据的探索揭示，TME中的旁观T细胞，如结直肠癌和肺癌中的旁观T细胞，与Trms共享相似性，可以表达共刺激或共抑制分子信号，但许多黑色素瘤反应性旁观细胞处于耗竭状态。旁观T细胞主要识别与局部肿瘤中的肿瘤无关的病毒抗原表位，并在没有抗原刺激的情况下快速分泌细胞因子，创造一个对Trms介导的肿瘤衍生炎症敏感的环境。然而，由于旁观T细胞无法检测肿瘤特异性抗原并与强抗肿瘤Teffs竞争营养物质，因此无法有效靶向恶性肿瘤，从而表现出其阻碍肿瘤免疫的潜力。此外，研究强调胆固醇合成是旁观T细胞生长、增殖和IFN-γ分泌的代谢机制，在单细胞分辨率下检测到，这可能与信号传导和免疫突触形成有关。然而，在代谢竞争条件下，旁观T细胞对Teffs和Trms的影响尚未确定。然而，还需要进一步研究旁观T细胞的其他亚群，以更好地了解它们在肿瘤免疫中的作用。

2.2.2 CD4⁺ T细胞代谢数据的异质性和趋同性

作为肿瘤细胞免疫中的关键辅助细胞，CD4⁺ T细胞通过促进或抑制CD8⁺ T细胞免疫应答具有双重调节功能。常规CD4⁺ T细胞(CD4⁺ Tconvs)通过产生各种细胞因子和直接诱导细胞毒性来发挥效应功能。Tregs构成了CD4⁺ T细胞的另一个特定群体，通常与预后不良和肿瘤进展相关。当CD4⁺ Tconvs和Tregs准备被激活时，有氧糖酵解和OXPHOS速率显著增加，Tregs表现出葡萄糖消耗和线粒体活性增加。值得注意的是，与CD8⁺ T细胞相比，CD4⁺ TILs更多地参与核苷酸代谢，谷氨酰胺代谢活性较低，这表明ROS增加CD4⁺ T细胞的IL-2释放，随后导致Th1细胞极化并激活细胞毒性CD4⁺ T细胞。

有氧代谢对CD4⁺ Teff功能的重要性

细胞毒性CD4⁺ T细胞在细胞因子产生的核心功能中高度依赖有氧代谢途径。在这些T细胞激活后，转录因子螺旋-环-螺旋家族成员E40(Bhlhe40)水平增加。在CD4⁺ Teffs中，受Bhlhe40调控的糖酵解酶(Pgk1、Eno1、Gapdh、Hk1、Pfkp)活性降低，而与线粒体代谢相关的转录因子(Cox6a1、Ndufb1-ps、mt-Nd3)水平降低，直接影响缺氧TME条件下^hiF-1α信号通路的激活。这些改变导致Teff呼吸速率和葡萄糖供应不足，增加细胞因子IFN-γ和集落刺激因子2(CSF2)以及细胞溶解因子Gzmb的表达。这项研究主要基于单细胞转录组水平的研究，间接说明了T细胞的代谢功能。然而，仍需通过代谢组学进一步验证以支持这些有价值的见解。与先前的流式细胞术分析结果一致，CD4⁺ Teffs没有表现出高乳酸耐受性。在酸性环境中，CD4⁺ Teff细胞的糖酵解和线粒体呼吸都受到严重阻碍，导致细胞毒性受损。

糖酵解重编程阻碍CD4⁺ T细胞向具有效应表型的T细胞分化。TME中CD4⁺ T细胞上免疫抑制检查点程序性死亡1(PD-1)的异常上调导致耗糖Teffs无法激活糖酵解效应途径或耐受低糖免疫抑制环境，驱使它们衰老或耗竭。此外，最近一项关于结直肠癌微环境中CD4⁺ T细胞亚群糖酵解相关差异依赖性的研究揭示，驱动Treg功能的转录因子MondoA或其靶蛋白TXNIP创造了一个非常适合Treg极化的低糖环境，并介导Treg分泌促炎细胞因子IL-17A。结果，间接诱导许多功能障碍的CD4⁺ T细胞形成，导致CD4⁺ T细胞免疫调节作用持续失衡。与Tregs相比，促炎CD4⁺ Th17细胞似乎表现出高有氧糖酵解，这是IL-17和IL-22产生的先决条件，从而分别增强自我更新和肿瘤细胞增殖。CD4⁺ Th17细胞在肿瘤免疫应答中的作用也不清楚。总之，这些结果表明，稳定CD4⁺ Teff糖酵解活性可保护Teffs并拮抗Tregs对TME的抑制作用。此外，糖酵解代谢及相关信号调节因子可能对Tregs和Th17细胞之间的相互转化和相互沟通至关重要。

谷氨酰胺代谢差异决定CD4⁺ T细胞特定亚群的建立

Th1和Th17细胞极化导致对谷氨酰胺代谢相关转运体和代谢酶依赖程度不同的细胞。谷氨酰胺在减少氧化应激方面的作用保护Th1细胞线粒体，促进细胞分化和增殖。在TME中氨基酸竞争的背景下，CTLA4⁺CD4⁺ Tregs表现出加速的谷氨酰胺代谢，但具有低谷氨酰胺代谢速率的CD4⁺ T细胞可以通过谷氨酰胺专一性转运体ASCT2摄取额外的谷氨酰胺，驱动Th1细胞亚群的建立，并将TME中Th1/Th2平衡向Th1细胞转移，以促进M1巨噬细胞和CD8⁺ Teffs的募集和激活，从而介导IFN-γ反应的上调。值得注意的是，Gls增加Th1效应分子相关通路激活IL-2/Stat5、糖酵解代谢速率、mTORC1/Myc信号通路激活和OXPHOS速率，而Th17细胞促炎活性降低。这些发现证实了TILs在葡萄糖和谷氨酰胺相互作用方面的代谢灵活性。在TILs中，葡萄糖和谷氨酰胺相互调节，赋予这些细胞代谢灵活性。此外，流式细胞术分析结合使用测序的转座酶可及染色质测定揭示，Gls和谷氨酸草酰乙酸转氨酶1活性直接或间接调节α-酮戊二酸/2-羟基戊二酸轴(α-KG/2-HG轴)，调节Th1和Th17细胞中染色质可及性和表观遗传修饰，从而发现和调节Th1和Th17细胞的分化。最近对代谢过程的研究仅限于动物模型和体外细胞系统。为全面阐明肿瘤代谢竞争背景下Th1/Th17细胞分化趋势以及特定CD4⁺ T细胞亚型代谢重编程与表观遗传标志物表达之间的关联，需要进一步研究，特别是单细胞多组学分析。

此外，Tregs中的免疫抑制信号由谷氨酰胺分解代谢控制。当Tregs中高水平代谢谷氨酰胺时，产生足够量的谷氨酰胺;谷氨酰胺是一种强效代谢物，可保护Tregs免受氧化应激，并调节与Treg浸润和分化相关的氨基酸(如谷氨酸、半胱氨酸和丝氨酸)的活性。抑制谷氨酰胺转运或GI诱导水解介导的拮抗作用使Tregs能够在缺乏谷氨酰胺的环境中生存，导致Foxp3⁺ CD25⁺CD4⁺ Tregs比例下降，阻碍Treg介导的肿瘤发生信号。此外，染色质免疫沉淀测序揭示，促进谷氨酰胺向α-KG转化通过增加2-HG水平正向调节Foxp3甲基化，增加Th17细胞分化速率，破坏Foxp3⁺CD4⁺ Tregs对肿瘤免疫功能的负调控。因此，谷氨酰胺的可用性对Treg促进的肿瘤进展很重要。然而，需要细化高通量scRNA-seq数据，以进一步阐明氨基酸代谢与表观遗传修饰之间的相关性。这些分析的结果可能支持谷氨酰胺双向调节作用的证据，并针对癌症治疗中细胞谷氨酰胺代谢的平衡点。

Treg特异性代谢状态以适应和增强免疫抑制环境

Tregs的共抑制作用依赖于细胞内脂肪酸合成和代谢。与CD4⁺CD25^-Foxp3^-Tconv细胞相比，CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ Tregs表现出更高的细胞内ATP水平以及更高的活性葡萄糖代谢和OXPHOS速率，导致迁移和增殖潜力增加。然而，Tregs过度糖酵解诱导的葡萄糖摄取对Foxp3表达不利，损害Tregs的免疫抑制功能。此外，Tregs可以驱动脂质代谢以支持自身的效应细胞免疫功能。PD-1信号联合类固醇调节元件结合蛋白(SREBP)启动过氧化物酶体增殖物激活受体-β信号，有效激活浸润Treg脂肪酸合成酶(FASN)，促使Tregs进行FAO以增加抑制信号稳定性(经scRNA-seq验证)。作为Treg脂质代谢和胆固醇合成的开关，CD70与CD27相互作用诱导PD-1信号，帮助维持线粒体完整性，促进CD4⁺Foxp3⁺CTLA-4⁺ Tregs内胆固醇和脂肪酸积累，建立针对IFNG的屏蔽系统。此外，在一项吸烟相关非小细胞肺癌患者T细胞发育轨迹的研究中，发现TNFRSF9^hiADAM12⁺CD4⁺ Tregs中脂质代谢通路异常活跃，作为ADAM12^-ITGB1相互作用诱导的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)⁺ Tregs向耗竭细胞转化的能量来源，这种高脂质代谢速率与终末ADAM12⁺CTLA-4⁺CD4⁺ Tregs中增强的脂肪酸合成密切相关。Tregs表面抑制性受体的激活是免疫抑制的重要机制，表明限制Tregs细胞内脂肪酸吸收和消耗可能逆转微环境中的免疫抑制。

系统代谢调节显然影响Tregs的抗炎活性，因为这些细胞可以通过感知细胞外代谢行为来调节自身的代谢状态。作为调控机体能量状态的主要类固醇激素，糖皮质激素在细胞葡萄糖和蛋白质代谢中发挥重要作用。根据从scRNA-seq数据生成的公共数据库分析，我们发现糖皮质激素刺激Tregs导致整个癌症中细胞TCA活性以及氧化还原系统-葡萄糖代谢相关信号核因子-κ-基因结合诱导激酶/核因子-κ-基因结合(NIK/NF-κB)转导能力整体下降。这些结果表明，糖皮质激素可能正向调节Treg糖酵解限速酶HK2的翻译，同时激活与氧化代谢相关的通路，确保Tregs中糖酵解的合理速率，促进Treg存活和分化。此外，肥大素工程溶酶体病毒治疗后T细胞的scRNA-seq分析揭示，作为合成增强剂和强效代谢调节剂的瘦素，通过重编程脂质代谢有助于维持T细胞线粒体稳定性并抑制Tregs的免疫抑制功能。总之，与生物节律相关的代谢信号可能是减弱TME细胞代谢的有前景的方法，通过调节Treg能量代谢可能在癌症治疗和免疫调节方面取得重大进展。

乳酸作为Treg特异性碳代谢枢纽，赋予Tregs代谢灵活性。免疫抑制微环境的不受阻碍的形成部分归因于乳酸抑制CD8⁺ Teff迁移而支持CD4⁺ Treg存活的矛盾作用。考虑到scRNA-seq数据，我们重现并检查了一组异质性Foxp3⁺ NKTregs，高表达CD4、CD25R、Foxp3、程序性细胞死亡1(PDCD1)、CTLA-4、诱导性共刺激分子(ICOS)和T细胞免疫受体与Ig和ITIM结构域(TIGIT)等，获得了与抑制性CD4⁺ Tregs非常相似的表型;这些细胞主动利用有利条件，有效地将乳酸转化为丙酮酸，随后进入线粒体TCA循环。此外，Tregs通过触发单羧酸转运体1(MCT1)主动吸收乳酸，间接限制Teffs上PD-1的表达。MCT1活性的增加正向调节Foxp3^- NKTregs利用细胞外乳酸的能力，乳酸脱氢酶B的过表达导致细胞内乳酸转化率、细胞氧耗和线粒体活性增加，从而重新启动Foxp3⁺ NKTregs的分化。此外，磷酸烯醇丙酮酸可以通过乳酸的碳合成，并可以作为Tregs中葡萄糖和糖原代谢的中间产物产生。首先，乳酸可以缓解Treg对高糖酵解的敏感性，其次，它为Tregs进入TCA循环提供了必要的燃料，从而促进其增殖和肿瘤生长促进能力。这些发现清楚地证实了乳酸是线粒体活性的替代燃料来源，但没有证实Treg的存活完全依赖于乳酸。最近一项基于SMART-seq的研究揭示了PD-1表达与细胞乳酸摄取之间的正相关，表明抗PD-1治疗的有效性可能受Tregs中乳酸代谢水平的影响。总之，Treg乳酸代谢与PD-1表达之间的关系可能对癌症治疗中的免疫检查点阻断(ICB)策略具有影响。

2.2.3 先天样T细胞的快速应答伴随代谢重编程

先天样T细胞(ILTCs)是连接先天性和适应性免疫的直接效应细胞，对周围环境的变化高度敏感，这些细胞可快速分泌炎症分子和组织保护因子。TME和正常环境之间的区别可以通过ILTCs表面的细胞因子受体快速感知，触发代谢重编程以最大限度地适应这些细胞对环境的变化，从而在肿瘤免疫监视中发挥作用，连接内在和适应性免疫应答。

ILTCs在胸腺中的发育和功能状态与代谢重编程密切相关。癌基因PTEN缺陷由于失去了对磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/mTOR信号通路的抑制作用而成为肿瘤发生的风险因素。同样，小鼠胸腺中17型ILTCs的PTEN缺乏与CCR6⁺CD27⁺TCRβ⁺iNKT17/MALT17细胞中OXPHOS、糖酵解和核苷酸代谢速率降低以及类固醇合成速率增加有关。这些变化导致iNKT17和MALT17细胞的线粒体活性和活力下降，暗示PTEN突变肿瘤中ILTCs增殖期的代谢过程失控。这项研究还揭示，PTEN缺陷的胸腺细胞通过上调P13K-mTORC协调机制或IL-23R/Stat3信号通路介导线粒体活性下调。这些通路可能有助于17型ILTCs在胸腺中的成熟和积累以及静止状态的发展，可能使肿瘤细胞逃避免疫监视。

γδT细胞的免疫应答与它们协调的碳和氮代谢通路错综复杂地联系在一起。这个细胞亚群通过适应肿瘤细胞产生的持续磷酸化抗原(PAgs)刺激达到作用阈值，导致浸润TME时免疫应答低下和细胞耗竭。例如，肝细胞癌患者的Foxg45β⁺LAG3⁺γδT细胞不能产生IFN和颗粒酶B等细胞毒性分子，它们的糖酵解和OXPHOS速率以及脂肪酸和多种氨基酸合成速率明显降低。令人惊讶的是，谷氨酰胺转运体SLC1A5似乎是活跃的，正向转移代谢底物到谷氨酰胺通路，进一步表明效应功能几乎丧失。TME中的γδT细胞倾向于通过氮代谢调整和依赖谷氨酰胺代谢以满足基本生存需求，并维持细胞内核酸和氨基酸合成。此外，最近的研究表明，γδT细胞的双重作用归因于不同效应因子的产生，分泌不同细胞因子程序的γδT细胞亚群具有不同的代谢通路需求，导致TME中γδT细胞的代谢重塑异质性。此外，整合scRNA-seq数据和线粒体膜电位数据的分析揭示，肿瘤浸润γδT细胞(CD27⁺γδTIFN)主要依赖糖酵解并高表达Myc，而主要分泌IL-17的γδT细胞(CD27^-γδT IL-17)参与线粒体氧化代谢，表现出特异性摄取脂肪酸和胆固醇的能力。葡萄糖转运体Glut1的失活导致IFN-γ水平降低，而不影响IL-17分泌速率，支持了这些发现。

总之，不同TILs的效应状态的所有动态变化、发育和分化过程中细胞亚群的相互转化以及抗癌或促癌功能的协调机制在一定程度上依赖于相似或不同的代谢通路(Figure 3)。了解调控T细胞亚群的代谢过程可能为在细胞代谢水平上阐明人类肿瘤进展和免疫治疗耐受的机制提供关键见解。

Figure 3：T细胞代谢的潜在调控靶点、信号通路和机制。葡萄糖、脂质和氨基酸代谢在T细胞代谢环境中错综复杂地联系在一起。靶向关键代谢酶、转运蛋白和蛋白质翻译机器可以直接或间接影响与代谢底物和中间产物相关的T细胞免疫功能。雷帕霉素复合物1(mTORC1)是一个重要的mTOR复合物,在复杂的代谢网络中发挥关键作用。图下方的面板突出了其中介作用。具体而言,mTORC1可以被不同的激酶和环境信号激活,并随后调节代谢相关转录因子的表达,从而改变与免疫功能相关的代谢过程,包括细胞生长、增殖和分化,以及细胞因子产生。细胞表面蛋白(CD47、CD39和CD73)、免疫检查点(程序性死亡1[PD-1]和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4[CTLA-4])以及共刺激配体和受体(CD27-CD70)在T细胞代谢控制中均发挥重要作用,甚至可以直接修饰T细胞依赖性代谢途径。此外,T细胞代谢途径与相关的阳性/阴性抗肿瘤通路的激活密切相关,并在多个水平上平衡T细胞免疫活性。

3.靶向T细胞代谢过程的治疗进展

基于不同T细胞亚群转录组表达富集的代谢途径差异，越来越多的研究相继提出，涉及T细胞激活、发育、分化和细胞因子产生效应通路的代谢途径可能是增强T细胞抗肿瘤免疫力的机制靶点(Table 1)。

3.1 靶向调节T细胞代谢增强T细胞抗肿瘤免疫

PI3K/Akt/mTOR信号通路参与T细胞的复杂代谢网络，介导TCR重排并直接调控各种营养物质的摄取、运输和分解代谢。mTOR信号整合来自能量和营养物质的信号，其活性与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性相关，上游Akt的激活可以直接磷酸化并诱导FoxO转录因子的核输出，抑制糖酵解抑制基因的翻译。虽然mTOR信号抑制通常被认为是免疫抑制的，但在某些环境中它可以促进增强免疫应答。mTORC信号的减弱可以增强共刺激信号，从而赋予T细胞更高的SCR并增加T细胞记忆持久性，它还可能导致Teff收缩/扩增比例失调。mTOR复合物，特别是mTORC1，是协调合成代谢和分解代谢的关键中间体，一方面，它可以介导HIF-1α、c-Myc等促进糖酵解和氨基酸代谢;另一方面，它可以激活下游SREBPs并参与脂肪酸合成酶(FASN、ACC等)的表达，调控脂质代谢。PIM激酶是丝氨酸/苏氨酸激酶家族的成员，控制参与细胞代谢和生存的各种蛋白质的磷酸化，与mTORC1信号活性密切相关，影响CD8⁺ T细胞记忆状态的形成。PIM激酶的全面抑制剂AZD1208抑制mTOR信号活性，防止ROS干扰CD8⁺ Teff线粒体代谢并恢复氨基酸转运，从而增加CD8⁺ T细胞毒性，促进Tm增殖和持久性。此外，二甲双胍磷酸化AMPK下调mTORC1，诱导CD8⁺ T细胞的糖酵解依赖性转化为FAO，有助于增强记忆表型的获得和细胞生存期的延长。相比之下，二甲双胍在Tregs中正向重编程糖酵解通路，弱抑制Foxp3和CTLA-4表型相关信号。因此，需要转录和表观遗传水平的数据来确定二甲双胍对AMPK/mTORC1轴的调节作用及相应代谢重编程的机制。不可否认，经临床前研究评估的二甲双胍可能是一种代谢激活的小分子药物，可增强肿瘤免疫力。相比之下，TCR诱导的锌指蛋白91(ZEP91)易位促进丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A复合物的组装，调控mTOR信号。在TILs中敲除ZEP91允许在高糖酵解期间通过mTORC1激活充分实现细胞效应功能。

脂质代谢对T细胞激活和长期生存是必需的，脂质代谢和糖酵解之间的相互转化表征了T细胞效应状态。在参与这种转化的因素中，重编程的脂肪酸代谢控制记忆表型的发展和基因的功能表达。脂肪酸合成通路的抑制是通过天真CD4⁺ Tn乙酰辅酶A羧化酶1介导的，它将这些细胞转化为CCR7^hiCD137^loCD4⁺ Tpms。这些细胞可能分化为具有完备记忆功能和高呼吸能力的Th1细胞，这是TME的中心。最近的研究表明，通过满足CD103⁺CD69⁺CD8⁺ Trm脂肪酸代谢来维持完备的记忆状态，可能防止转化的EOMES⁺CD8⁺ T细胞耗竭，从而间接减弱获得性表皮生长因子受体(EGFR)-酪氨酸激酶抑制剂耐药性和ICB治疗反应。此外，如前所述，胆固醇代谢与CD8⁺ Teff相关抗肿瘤免疫的不利影响有关。抑制或敲除FIBP的CD8⁺ T细胞由于阻断胆固醇合成酶基因表达和增加胆固醇外排泵蛋白ATP结合盒转运体ABCA1的蛋白表达而表现出胆固醇积累受限。诚然，用于降低预激活T细胞胆固醇水平的他汀类药物阻止Tns接受抗原刺激，从而抑制其增殖。同样，激活的糖皮质激素不仅调节Treg葡萄糖代谢，而且抑制抗原特异性T细胞应答。11-β-羟基类固醇脱氢酶-1(HSD11B1)将细胞内惰性糖皮质激素转化为活性糖皮质激素，而不是系统性糖皮质激素。HSD11B1的药理学抑制保护TILs免受免疫监视和肿瘤杀伤能力，增加IFN-γ信号诱导免疫检查点抑制剂(ICI)应答，但可能加剧免疫相关不良事件(irAEs)的风险。

TIL竞争期间消耗的营养物质的外源性补充通过恢复初始免疫效应功能发挥积极作用。例如，SAM是CD8⁺ T细胞组蛋白甲基化酶的底物，在蛋氨酸代谢和上位遗传修饰之间建立联系。蛋氨酸补充抑制T细胞对蛋氨酸竞争的持续抑制作用，恢复正常的H3K79甲基化到细胞内S-腺苷甲硫氨酸(SAM)水平。这种细胞对蛋氨酸竞争的恢复在一定程度上抑制了免疫抑制性相互作用对诱导CD4⁺ T细胞激活。尽管T细胞表观遗传和代谢模式的变化共同决定了T细胞分化，例如向具有效应、维持记忆或耗竭表型的T细胞转化，但表观遗传重塑或代谢过程的增加是否能完全逆转T细胞功能障碍尚不清楚。通过scRNA-seq数据分析，已证明通过二甲双胍控制TME中的代谢色氨酸竞争，可以恢复CD8⁺ T细胞的色氨酸可用性，从而改变CD8⁺ Teff命运。N-乙酰半胱氨酸通过增加细胞内钙负荷和氧化还原能力，增强有氧糖酵解代谢以产生ATP，恢复耗竭T细胞的自我更新依赖的干性。此外，CD8⁺ T细胞的抗肿瘤活性依赖于细胞内L-精氨酸浓度。可用L-精氨酸的摄取加速CD8⁺ Teff OXPHOS和TCA循环进程，通过抑制糖酵解代谢保护细胞免受肿瘤Warburg效应的恶性后果。当L-精氨酸浓度升高到特定水平时，Teff向Tcms分化加速以优化TME生存。值得注意的是，精氨酸酶抑制剂OAT-1746可能诱导比由ICI和STING激动剂DMXAA组成的双药方案更好的治疗反应，以激活内在免疫应答，但这一方案未能克服免疫效应不足。总之，必须开发更精确的氨基酸相关免疫代谢过程探针，为创新抗肿瘤药物的临床试验提供指导。

适量谷氨酰胺的双重作用表明，谷氨酰胺代谢调节佐剂必须在明确的时间窗口内以适当剂量给药。首先，谷氨酰胺代谢稳态对T细胞蛋白质产生和免疫活性至关重要。通过拮抗Gl诱导的谷氨酰胺水解，JHU083治疗增强Th1和CD8⁺ Teff细胞的OXPHOS，以防止氧化应激增加后的凋亡和自噬，并与EGFR肽疫苗(EVax)联合使用，这种治疗可能促进长期免疫力。由于Teffs缺乏平衡的效应功能，它们浸润到以KRAS、STK11/Lkb1、KEAP1和其他癌基因突变携带的晚期肺腺癌为特征的环境中严重减少，肿瘤细胞摄取谷氨酰胺的速率显著增加。值得注意的是，Gls治疗(如CB-839)与抗PD-1/PD-L1联合进一步减少CD8⁺ T细胞克隆扩增。值得注意的是，ICB治疗需要谷氨酰胺水解，加剧了Teffs利用谷氨酰胺的压力。考虑到谷氨酰胺的多重代谢作用，我们推测可能存在一个精确的治疗剂量或应用窗口，有助于T细胞GIs与免疫治疗的协同作用，确定这些参数将有助于确定谷氨酰胺正面或负面影响抗肿瘤免疫力的代谢机制。

越来越多的证据表明，区分不同T细胞亚群特性的表面蛋白质介导T细胞代谢的异常重编程，导致ICI耐药相关的免疫抑制信号和肿瘤免疫逃逸。由于CD70表达与Treg线粒体健康和细胞内脂质含量相关，CD70表达受损会降低Treg对TME的适应性，导致其对肿瘤逃逸环境的效应细胞免疫抑制支持丧失。因此，晚期ICI耐药肿瘤患者可能特别受益于联合抗CD70单抗治疗。同样，TME中CD47过表达允许肿瘤细胞避免免疫监视。阻断T细胞CD47表达刺激Teff糖酵解效率持续增加，重建经典细胞毒表型。此外，临床试验表明，CD47单抗与ICIs联合导致肿瘤负荷减轻和生存期延长。此外，许多研究表明，阻断CD39或CD73抑制细胞外ATP降解产生ADO，防止ADO破坏Teff细胞因子产生或与癌细胞的直接接触。所有这些发现表明，通过抗表面抗原表达药物重塑T细胞能量代谢可能增强肿瘤免疫治疗效果，表明在长期常规治疗获得性耐药的癌症中存在持久的免疫应答。

3.2 CAR-Ts的代谢预处理可能提高免疫治疗效果

体外使用嵌合抗原受体(CAR)对T细胞进行基因改造，赋予这些T细胞肿瘤抗原特异性效应和局部活性，拓宽了肿瘤免疫治疗的前景。研究表明，不同的CAR信号域可以重塑T细胞能量代谢程序以介导特定的免疫学差异(Figure 4)。因此，工程化T细胞代谢过程可能使T细胞在竞争能量和代谢底物方面优于肿瘤细胞，从而增强CAR-T在体内输注后的毒性和持久性。

Figure 4: 优化嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）治疗疗效的代谢措施和靶点。CAR-T治疗用于靶向和有效破坏肿瘤细胞。一方面,线粒体呼吸电子传递链产生三磷酸腺苷(ATP)的能力得到增强。此外,脂肪酸和脯氨酸代谢的增加促进了记忆状态的分化,这一过程对T细胞的免疫攻击能力、寿命和可用性是必需的。相反,对预先设计的T细胞糖酵解状态的负调控抑制T细胞采用糖酵解代谢程序作为线粒体代谢的替代方案,防止这些细胞在肿瘤微环境(TME)中利用其竞争优势。当T细胞的线粒体功能增加而T细胞的糖酵解活性受到抑制时,CAR-Ts更有效和更强烈地发挥细胞毒作用。

早期实验结果表明，CAR-Ts支持强大的线粒体健康度并增强线粒体代谢，产生足够的能量用于CAR-Ts介导的长期免疫力。具有4-1BB/CD137信号的CAR-Ts在线粒体氧化活性方面表现出巨大优势，增加T细胞SRC，从而减少T细胞长期生存能量供应。通过采用Cas9-CRISPR编辑技术修改CAR-Ts中PD-1位点的表达，学者们发现PDCD1敲除的4-1BB CAR-Ts的线粒体能量储备能力增强，增加OXPHOS和糖酵解速率，使这些细胞能够适应高度代谢的TME。或者，发现敲入脯氨酸可增强线粒体的能量储备能力。缺乏脯氨酸脱氢酶2的CD22 CAR-Ts通过多种氨基酸代谢过程增加线粒体功能以支持细胞溶解颗粒分泌，并显示Tm细胞样特征。此外，mTORC1/PGC1α通路的激活对促进线粒体生物合成很重要，介导CD8⁺ Tcm细胞的代谢适应性、抗ROS应激和自我更新。PGC1α过表达CAR-Ts与ICI联合治疗对增强T细胞有氧代谢活性具有协同作用。体外培养模型的数据表明，线粒体中的OXPHOS和生物合成通路可能是增强靶向CAR-T抗肿瘤免疫优势的潜在靶点，但也必须研究体内肿瘤模型以充分理解CAR-T代谢可塑性和可行编辑的机制。

抑制CAR-T糖酵解有助于CAR-T在TME中的持久应答，并防止过度细胞因子释放引起的全身炎症。与表达4-1BB的CAR-Ts相比，CD28通过诱导糖酵解通路、转运蛋白和PI3K/Akt信号通路中核心酶的快速激活，刺激CAR-Ts暂时杀死肿瘤细胞。随着大量细胞因子迅速释放到微环境中，细胞减灭手术的风险大大增加。电子传递链(ETC)复合物V抑制蛋白腺苷三磷酸抑制因子1(ATPIF1)维持线粒体结构和电子传递链的功能稳定性。异基因CD19 CAR-Ts中ATPIF1敲除增加糖酵解活性以补偿线粒体缺陷，同时降低这些细胞通过其他能量底物(如脂肪酸或氨基酸)产生ATP的能力，抑制CD8⁺ Tm形成和毒力因子产生，加速CD8⁺ Teff耗竭。总之，糖酵解抑制剂2-DG和选择性PI3K抑制剂均可能有助于增加Tcm/Tem比率，限制CAR-T糖酵解活性以维持持续干性。值得注意的是，低氧TME中TGF-β/Smad信号通路的激活往往降低T细胞糖酵解竞争力;因此，CAR-Ts中TGF-βR2的敲除抑制TGF-β信号，促进CAR-T体内存活，提高肿瘤清除效果。通过共同靶向PD-1和TGF-β的CAR-Ts进一步增强T细胞的抗肿瘤和抗自身耗竭活性。然而，是否可以将强大的效应或免疫记忆持久的CAR-Ts用作对抗肿瘤的优越武器尚有争议。此外，需要进一步研究TGF-β编辑对CAR-Ts葡萄糖代谢和OXPHOS的调节作用以及其他交叉通路的同时调节。

4.展望与总结

4.1展望

随着基于scRNA-seq的肿瘤特异性T细胞代谢研究的成熟，同时利用scRNA-seq和T细胞代谢谱数据促进了控制TME可塑性的不断进步，拓宽了免疫治疗潜力的范围。因此，我们提出了几个前瞻性和综合性研究的方向(Figure 5)。

Figure 5：单细胞转录组测序应用于T细胞代谢分析的未来前景。基于T细胞代谢的单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析,未来对单个T细胞代谢活性的研究可能涉及以下步骤:

(1)为免疫沙漠型肿瘤设计免疫重激活治疗; (2)构建代谢预后模型并进行聚类分析; (3)预测癌症生存并明确肿瘤进展机制和有前景的治疗方法; (4)将患者引导至扩展的多组学分析领域,进行异质性信息分析; (5)探索免疫相关不良事件(irAEs)的预防。

4.1.1 靶向代谢是否可以重新激活T细胞对ICB的敏感应答?

虽然scRNA-seq促进了对"免疫反应"TILs的分析，但很少有研究集中探索"免疫沙漠"肿瘤中弱免疫应答或TILs向肿瘤边缘移动拒绝的机制。仍然存在以下问题:TILs是在能量耗尽后主动撤退还是被动排斥?T细胞募集和浸润失败是否可归因于TME中影响T细胞基因转录和表观遗传特征的环境变异?有趣的是，与以广泛T细胞浸润为特征的热肿瘤相比，冷诱导肿瘤对ICIs的反应更强。特别是，许多热肿瘤内的优势细胞群包括无反应性的旁观T细胞，需要重新考虑CD8⁺ T细胞丰度作为肿瘤定义标准的可靠性。总之，调控抗肿瘤Teffs循环和转运的多种潜在机制表明联合免疫治疗方案有前景。

4.1.2 单细胞多组学如何克服使用scRNA-seq数据分析T细胞信息的局限性?

虽然scRNA-seq在识别新的细胞亚群和探索细胞功能异质性方面表现出强大的能力，但单细胞蛋白质组学(sc-proteomics)分析作为转录RNA翻译和修饰的功能分子蛋白质，具有几个优势。首先，仅依赖RNA丰度不能直接推断细胞内蛋白质丰度，结果仅限于转录组水平。其次，单细胞分辨率的蛋白质组学分析可以揭示转录组学无法实现的翻译后修饰。第三，sc-proteomics通过表达参与细胞间配体-受体相互作用、粘附分子、酶和其他蛋白质的蛋白质，实现细胞crosstalk的多层次分析。这一观点允许从细胞间相互作用的角度解释复杂的肿瘤免疫微环境。总之，TME中众多T细胞群体的异质性因其分化状态、代谢模式和功能效应而异，通常不限于或完全独立于转录组差异，因此仅通过scRNA-seq数据无法完全捕获。因此，单细胞多组学技术的出现对于应对这些挑战非常重要。研究单细胞染色体可及性、组织空间测绘、膜蛋白表达谱和TCR-seq将导致全面表征单个T细胞分子和位置、多个相关基因和蛋白表达特征以及免疫制药靶点筛选。例如，γδT细胞介导的功能状态异质性、代谢可塑性和对ICIs的特异性反应仍然未知。基于发育位点、结构或效应分子区分γδT细胞亚群未能充分识别重叠分类或阐明特定代谢和基因组染色质状态对功能障碍的变化。我们设想，可以通过使用单细胞转录组学和多组学研究技术揭示γδT细胞特异性标志物的表达、对PAg刺激的表观遗传变化和相关代谢重塑过程、γδT细胞与TME中αβT细胞的相互作用、它们的相对位置以及联合药物诱导的这些分子丰度增加，以期在未来开发基于γδT细胞的可行靶向治疗方案。

此外，代谢组学分析包括代谢基因表达水平、调节行为、底物结合、代谢酶和生成的代谢物之间的相关性，正越来越多地应用于单细胞研究。通过将单细胞多组学分析应用于CAR-T治疗的开发，研究人员可以通过测量分化和突变标志物以及细胞间相互作用通路激活水平，连续跟踪T细胞亚群克隆的动态变化，深入研究细胞基因组、细胞之间的空间关系以及其他关键信息。这种方法将导致识别用于改进CAR-T治疗的非常精确的关键分子，从多个角度评估线粒体代谢水平和TME对输注后CAR-Ts功能状态的影响，并预测CAR-T治疗获得的临床获益程度。

由于之前的研究主要集中在单细胞转录组学上，复杂细胞代谢模式的分析应充分考虑单个细胞、各种代谢物、功能小分子和细胞表观遗传特征之间的相互作用。然而，这些方面代表了一个重要的未开发领域。总之，未来的研究还应采用多组学整合研究方法，深入探索临床疾病的实际免疫状态和代谢模式，从而为T细胞代谢与免疫功能之间的关联提供更多令人信服的证据，并为不同肿瘤治疗策略建立代谢相关的预测模型。

4.1.3 单个T细胞的代谢模式是否可以揭示未来生存预后探针的新靶点?

确实，将T细胞代谢组与基因组生物标志物分析相结合以分类内源性代谢途径，可能为肿瘤治疗的预后预测增加新的维度。最近，脂质代谢基因预后特征在肿瘤患者生存、免疫浸润、细胞突变和治疗预后方面得到成功验证，并通过基于scRNA-seq的构建分析在肝细胞癌患者中得到验证。此外，一些受关注较少的代谢途径(如硒代谢、多胺代谢和叶酸代谢)对肿瘤预后的影响已得到初步验证数据的支持。

在免疫治疗背景下，已确定几种方法(包括T细胞相关预后指数和免疫治疗生物标志物的多指标分析，如CAMOIP)评估接受ICIs治疗的患者预后的创新价值，这是免疫代谢组学实现新预后模型开发的另一个方向。此外，scRNA-seq已被证明对挖掘肺腺癌、肺鳞状细胞癌和三阴性乳腺癌的T细胞标志基因以及识别相关富集术语和通路以构建疾病风险和免疫治疗反应的独立预测模型具有价值。差异表达基因的全面覆盖、基因集富集通路的稳健分析以及T细胞中肿瘤浸润相关基因的敏感和特异性检测使基于单细胞测序数据成为构建精确和敏感的浸润T细胞代谢预后风险模型的宝贵资源。

4.1.4 是否可以表征TME中参与不同代谢过程的细胞之间的复杂相互作用，以阐明肿瘤进展的分子机制或适应性T细胞的治疗潜力?

我们推测T细胞的抗肿瘤免疫应答与周细胞活性之间的关系可能通过细胞间通讯通路介导，或者与周细胞内代谢废物积累增加有关。例如，Crif敲除后肝细胞癌细胞线粒体功能障碍导致葡萄糖分解代谢增加至丙酮酸和乳酸过度积累。这一过程引起的不利细胞环境导致浸润Teffs的表面效应受体(IFN-γ、肿瘤坏死因子[TNF]和T-bet)表达下调。恶性细胞和T细胞之间与代谢相关的相互作用在塑造TME内的免疫应答方面起关键作用，为靶向肿瘤细胞代谢以介导和改善T细胞代谢重塑的策略提供新见解。

此外，据认为新型肿瘤治疗剂(如铜死亡和DNA损伤应答抑制剂)通过增强cGAS-STING-IFN内在免疫通路的激活，招募分泌IFN-γ、TNF-α和IL-2的T细胞到TME，作为T细胞募集和重塑肿瘤细胞免疫抑制代谢状态(如IDO-1介导的色氨酸降解和脂肪酸代谢紊乱)的中介。值得注意的是，类固有T细胞(如CD161^hi+CD8⁺ T细胞)通常无法识别肿瘤亚克隆抗原，在复发/转移性肿瘤背景下表现出有限的肿瘤裂解和克隆扩增能力。此外，上皮-间充质转化和NOTCH信号等死亡过程通常与有氧代谢增加和预后不良肿瘤中活化耗竭T细胞相互作用对显著相关。显然，在不增强固有杀伤效应的情况下阐明加速T细胞耗竭过程是开发新疗法以使原发和复发/转移患者受益的关键。

4.1.5 重编程T细胞和微生物代谢过程是否可以有效减少irAEs的数量?

几项单细胞研究表明，ILTC代谢倾向于向FAO转变，抑制炎症调节因子IL-22的释放，这是抗PD-1治疗后增加结肠炎发生的启动因素。出乎意料的是，将代谢调节剂与ICI治疗相结合可能增加irAEs的发生率。这一结果强调需要通过阻断T细胞的异常代谢重编程或主动引导T细胞代谢过程，找到克服ICIs引起的irAEs的合理解决方案。修改肠道微生物系统并因此增强免疫治疗通常依赖于短链脂肪酸来确保肿瘤细胞组蛋白乙酰化，为有益微生物和抗肿瘤免疫系统创造有利环境。这种方法可能在一定程度上预防消化系统irAEs的发生。目前，我们强调需要使用多个实验细胞系模型进行彻底的体外验证，同时使用动物模型和人体受试者进行体内实验，以深入了解药物组合共同操纵的机制。

5.结论

早期科学家们就开始使用流式细胞仪分析研究T细胞亚群之间的差异。在过去十年中，随着单细胞转录水平的精确度不断提高，人们开始识别T细胞激活后的过渡或掩蔽分化表型，从而揭示了以前被忽视的T细胞亚群的异质性特征。同时，可以用流式细胞术等下游实验来验证准确性。然而，我们必须承认，scRNA-seq中细胞群的过度分割仍然存在风险，可能将真正具有生物学意义的亚群与假设的亚群混淆。此外，scRNA-seq先进的计算方法，如动态轨迹建模、差异表达或通路富集分析和降维，可以深入描述细胞异质性和多维状态。总体而言，将scRNA-seq与互补的实验策略相结合有望推进我们对单细胞分辨率下T细胞多样性、可塑性和功能的理解。

通过抗肿瘤免疫，不同T细胞亚群中的代谢受到周围因素的调节，如周围环境的变化、代谢酶活性和抗原刺激传递的信号，它们为细胞亚群中的免疫机制提供特定指令。因此，TILs和外周循环反应性T细胞亚群的代谢动力学、趋同性和异质性决定了T细胞生存、细胞毒性、增殖和生长相关信号通路活性;细胞内氨基酸或蛋白质丰度;以及分化方向和表型获得。这种复杂性意味着，了解T细胞不同代谢程序调控免疫功能的相关机制，整合将T细胞亚群连接或限制到TME的代谢模式和信号因素，将能够在免疫代谢领域进一步扩展肿瘤治疗策略。