肿瘤研究千千万，单个基因发顶刊！它凭什么突出重围？

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肿瘤研究千千万，单个基因发顶刊！它凭什么突出重围？ by 生信人

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早吖！小伙伴们！一月底，《Cell》杂志发表了一篇哥伦比亚大学Alberto Ciccia教授课题组的文章，他们发现SMARCAL1是促进肿瘤免疫逃逸的双重调节器，既可抑制先天免疫信号传导，又能诱导PD-L1介导的免疫检查点反应。在小鼠模型中，SMARCAL1的缺失增强了抗肿瘤免疫反应，验证了SMARCAL1在癌症免疫治疗中的潜力。话不多说，直接步入正文吧~

一、背景介绍

基因组不稳定性可触发癌症内在的先天免疫反应，从而促进肿瘤排斥反应。然而，癌细胞可通过过度表达免疫检查点调节因子（如PD-L1）来逃避免疫检查点阻断（ICB）治疗。DNA损伤应答（DDR）和染色质调控对于维持基因组稳定性和控制基因表达都至关重要，有研究表明，靶向癌细胞中的某些DDR因子或染色质调节因子可通过诱导癌症固有的先天免疫信号传导来增强抗肿瘤反应。上有政策，下有对策，肿瘤细胞也有多种免疫抑制机制来对抗癌症内在先天免疫的激活。因此，在诱导癌症自主免疫刺激信号的同时，也要采取策略限制PD-L1介导的免疫逃避，从而增强免疫治疗的效果。这篇文章发现DDR因子SMARCAL1，一方面，通过限制内源性DNA损伤，抑制癌细胞生长过程中的cGAS-STING依赖性信号传导。另一方面，它又与AP-1家族成员 JUN一起维持PD-L1转录调控元件的染色质可及性，从而促进癌细胞中PD-L1的表达。这表明SMARCAL1是抗肿瘤免疫的重要调节因子。

二、主要结果

1、CRISPR-Cas9筛选免疫调节因子

为了识别调控癌症固有免疫信号和PD-L1水平的DDR和染色质因子，作者选择了三阴性乳腺癌MDA-MB-436细胞，用慢病毒单向导RNA(sgRNA)文库进行转导，然后采用基于荧光激活细胞分选(FACS)的CRISPR-Cas9筛选（图1.A-B）。经过多重比较分析，识别出了被多个sgRNA靶向的基因（图 1C-1E），其中sgRNA耗竭最显著的细胞具有较高的核IRF3水平，而靶向CTCF、RAD2和SMC3（PD-L1和细胞内在免疫特征的负调控因子）的 sgRNAs则在高表达核IRF3和PD-L1的细胞中富集，表明该策略可以识别同时调控IRF3 介导的免疫刺激信号和PD-L1水平的因子。

图1 筛选调控基因

2. SMARCAL1的缺失触发细胞内在免疫反应并下调PD-L1

研究发现在SMARCAL敲除以及耗竭的细胞中，PD-L1的表达水平降低（图2.A）。此外，这些SMARCAL1缺失的细胞表现出了较高水平的S386磷酸，标志着IRF3的激活 (图2.B）。总的来说，这些发现表明SMARCAL1缺失同时下调 PD-L1并诱导IRF3激活。Hallmark基因集富集分析以及RNA-seq揭示了 SMARCAL1缺失的细胞中细胞周期调控相关通路的下调以及IFN依赖性和细胞内在免疫信号通路的上调（图2.C-F）。此外，SMARCAL1缺失的MDA-MB-436细胞表现出更高的细胞因子蛋白水平（图2.G-H），并且酪氨701上的STAT1 磷酸化(IFN 激活的标志物)增强（图2.I）。RNA-seq和RT-qPCR基因表达分析表明在SMARCAL1缺失的细胞中，PD-L1的下调源于CD274基因转录的下调（图2.J-K）。总而言之，多种细胞中发生的SMARCAL1依赖性PD-L1下并不依赖于IFN。

图2 PD-L1的表达分析

3. cGAS-STING 依赖性细胞固有免疫的激活

SMARCAL1在保持基因组完整性中起着一定作用，研究中的SMARCAL1-KO细胞也表现出了DNA断裂、γH2AX焦点、染色质桥和微核水平的增加（图3.A）。SMARCAL1的缺失也会增强细胞内的cGAMP（可激活STING和IRF3-介导的转录）水平（图3.B），即SMARCAL1缺失会导致细胞cGAS-STING依赖性固有免疫信号的上调，而cGAS或STING耗竭都会降低SMARCAL1缺失细胞中IFNB1和其他炎症基的表达（图3.D）。通过实验设计，作者发现在未受干扰的细胞生长过程中，SMARCAL1的 ATP 酶和HARP结构域对限制cGAS依赖性信号传导是必需的（图3.E-G）。

图3 SMARCAL1缺失细胞中的内源性免疫

4. SMARCAL1的失活下调PD-L1表达

SMARCAL1在DNA损伤期间可稳定复制叉，在SMARCAL1耗竭的细胞中，PD-L1的表达水平降低，而其他重塑停滞复制叉的基因，如ZRANB3和HLTF，它们的耗竭并不会下调PD -L。此外，作者发现在循环期和非循环期细胞中， SMARCAL1的消耗都会降低PD-L1的蛋白质和mRNA水平（图4.A-C），而且SMARCAL1直接通过转录调控来调节PD-L1的水平（图4.D-E）。通过ATAC-seq，研究发现了SMARCAL1缺失细胞中染色质可及性区域的整体丢失（图4.F），识别了三个不同的可及性峰，每一个都与富含H3K27ac的区域重叠(图 4.G）。其中，P3峰对应促进PD-L1表达的顺式调控元件，抑制P3元件会降低对照细胞中的PD-L1 mRNA和蛋白质水平，而不改变SMARCAL1耗竭细胞中的PD-L1表达（图4.H-I)，表明P3峰在SMARCAL1缺失细胞中可能是不可及的。ChIP进一步揭示了SMARCAL1通过其ATP酶活性保留P元件的染色质可及性，从而促进PD-L1表达（图4.J-K）。

图4 SMARCAL1对PD-L1表达的调控

5. SMARCAL1与JUN共同刺激PD-L1表达

研究识别出了142个受SMARCAL1丢失影响的TFs，然后利用CRISPR-Cas9 和慢病毒转染，又筛选了15个TFs，它们的sgRNAs 在SMARCAL1充足的PD-L1low细胞群体中富集，表明它们可能参与SMARCAL1依赖性PD-L1的调控（图5.A-B）。作者通过BioID实验了分析上述TFs与SMARCAL1的互作，发现在SMARCAL1缺失细胞中，将近一半的SMARCAL1结合位点JUN结合区域重叠（图5.F）。从头基序分析也在SMARCAL1结合区域相关的前三个基序中识别出了AP-1 JUN样基序（图5.G）。在JUN耗竭的细胞中的H3K4me3和 JUN结合区域，SMARCAL1信号显著减少（图5.H），揭示了JUN在转录活性区域附近定位和/或稳定SMARCAL1的作用。研究还发现，SMARCAL1和JUN通过保留前文提及的P3元件的可及性来协同调节PD-L1的表达，但它们不调节彼此的蛋白丰度（图5.I-J）。

图5 识别与SMARCAL1共同促进PD-L1表达的TF

6. SMARCAL1丢失增强T细胞介导的抗肿瘤免疫

在小鼠实验中，作者发现Smarcal1缺失会导致细胞内在免疫信号的激活，显著抑制肿瘤生长，减小肿瘤尺寸（图6.A-B），但并未调节PD-L1的水平。然而，当细胞中 Cgasb被破坏后，肿瘤生长增加且存活率降低（图.6C-D），表明 Smarcal1q缺失引发了cGAS依赖性抗肿瘤免疫反应。流式细胞术显示，在 Smarcal1缺失的肿瘤中，肿瘤内免疫细胞，如CD8+ 细胞毒性T细胞和CD4+ T显著增加，而CD8+ T细胞则是抗肿瘤免疫反应的重要效应器（图6.E-F）。这些发现表明，Smarcal1失活会诱导肿瘤固有的胞质DNA传感，从而增强肿瘤免疫原性和细胞毒性T细胞介导的肿瘤排斥，其缺失诱导的PD-L1下调也有助于抗肿瘤免疫（图6.H-I）。

图6 SMARCAL1缺陷癌细胞的抗肿瘤免疫分析

7. SMARCAL1的表达与不良临床结果相关

抗CTLA-4抗体显著抑制了Smarcal1缺失的小鼠肿瘤，提高了存活率，抗PD-L1和抗CTLA-4抗体的联合治疗，进一步增强了这一效果（图7.A-C）。基于TCGA数据集，研究发现SMARCAL1在人类癌症中很少发生突变、扩增或缺失，但它在大多数肿瘤中过表达（图7.D）。在SMARCAL1表达水平较低的肿瘤中，细胞增殖、c-Myc活化、转化生长因子β信号传导和DNA修复等通路下调，而炎症反应相关的通路则上调（图7.E）。在53%肿瘤类型中，SMARCAL1Low和SMARCAL1High组之间的白细胞评分比值大于1，并且与SMARCAL1Low组的炎症反应特征呈正相（图7.F），表明SMARCAL1缺乏会诱发白细胞浸润。

图7 SMARCAL1表达分析

三、小结

这篇单基因机制研究工作量足够多，分析思路清晰，而且层层递进，从多角度揭示了SMARCAL1在抗肿瘤反应中的角色。作者首先筛选了调控先天免疫和PD-L1水平的因子，然后选择了比较有研究价值的SMARCAL1，发现该基因的缺失会刺激先天免疫，并下调PD-L1，这与已知的调节因子相反。通过进一步的实验，作者发现SMARCAL1通过限制内源性DNA损伤、维持基因组稳定性来抑制cGAS-STING的激活，并通过控制PD-L1位点的染色质可及性来调节PD-L1。此外，研究还阐述了SMARCAL1在肿瘤免疫治疗中的潜在作用。然而，该研究也存在一些不足，比如研究抗肿瘤免疫反应时，没有评估SMARCAL1抑制对免疫细胞的影响；此外，后面大部分实验是在小鼠模型中进行的，在人类肿瘤中的作用还需要进一步验证等。今天的分享就到这里啦，have a nice day !

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