泛癌空间分辨单细胞分析揭示了癌症相关成纤维细胞与肿瘤微环境之间的串扰

泛癌空间分辨单细胞分析揭示了癌症相关成纤维细胞与肿瘤微环境之间的串扰 by 作图丫

导语

癌症相关成纤维细胞（CAF）是一种异质细胞群，在重塑肿瘤微环境（TME）中发挥着至关重要的作用。在这里，通过对六种常见癌症类型的空间和单细胞转录组数据的综合分析，我们确定了 CAF 的四个不同的功能亚组，并描述了它们的空间分布特征。此外，还对来自另外三种常见癌症类型的单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 数据和两个新生成的罕见癌症类型（即上皮肌上皮癌 (EMC) 和粘液表皮样癌 (MEC)）的 scRNA-seq 数据集进行了分析，扩展了我们对 CAF 异质性的理解。在空间背景下进行的细胞-细胞相互作用分析强调了基质 CAF (mCAF) 在肿瘤血管生成中的关键作用和炎症 CAF (iCAF) 在塑造免疫抑制微环境中的关键作用。在接受抗 PD-1 免疫治疗的乳腺癌 (BRCA) 患者中，iCAF 在促进癌细胞增殖、促进上皮间质转化 (EMT) 以及有助于建立免疫抑制微环境方面表现出更强的能力。此外，基于 iCAF 的评分系统显示与黑色素瘤患者的免疫治疗反应显着相关。最后，我们为研究者提供了一个网络界面（https://chenxisd.shinyapps.io/pancaf/）来研究泛癌背景下的 CAF。

背景介绍

今天小编为大家带来一篇泛癌空间分辨单细胞分析揭示了癌症相关成纤维细胞与肿瘤微环境之间的串扰发表在Molecular Cancer的新进展。题目为

Pan-cancer spatially resolved single-cell analysis reveals the crosstalk between cancer-associated fibroblasts and tumor microenvironment。

研究设计

在这项研究中，我们描绘了六种常见癌症类型中 CAF 的情况，并描述了这些亚型的独特功能特征。我们还分析了另外三种常见肿瘤和两种新测序的罕见肿瘤的 scRNA-seq 数据，以扩大我们对 CAF 异质性的理解。通过整合 scRNA-seq 数据和 ST 数据生成的跨越6个肿瘤（包括744,289个细胞）的空间单细胞转录组图谱用于描述CAF的空间分布特征，并表征 CAF 和 TME之间复杂的相互作用。值得注意的是，基于炎症CAF (iCAF)生成的评分显示与黑色素瘤患者对免疫治疗的反应显着相关。总之，我们的综合数据资源为针对TME中CAF的治疗策略的开发提供了新颖的见解和指导。

结果解析

1. 泛癌空间单细胞转录组图谱的构建

为了建立泛癌症的空间单细胞景观，我们获取了 56 名被诊断患有六种常见癌症类型之一的患者的 69 个样本的 scRNA-seq 数据，以及来自 22 名患者的 22 个组织切片的 ST 数据（图 1a）。其中，10个组织切片的ST数据具有来自同一患者的相应scRNA-seq数据（图1c）。我们收集的数据包括六种癌症：BRCA、结直肠癌（CRC）、肝癌（LIHC）、卵巢癌（OVCA）、前列腺癌（PRAD）和子宫体子宫内膜癌（UCEC）。经过严格的质量控制和过滤，scRNA-seq数据中总共有163,919个细胞和ST数据中的59,529个点被保留用于下游分析（图1d）。在 scRNA-seq 数据集中，每个细胞的独特分子标识符 (UMIs) 的中位数为 3955 个，每个细胞的基因数中位数为 1425 个。对于ST分析，每个点的UMI中位数为 11,139，每个点的基因中位数为3,863。为了最大限度地减少不同scRNA-seq 数据集之间的批次效应，我们独立分析了每个数据集。以结直肠癌为例，我们使用基于图的聚类，根据不同细胞类型的典型标记物识别了七个主要簇，包括上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、T&NK、B细胞、骨髓细胞和肥大细胞（图1e和f）。CopyKAT用于估计肿瘤的单细胞拷贝数变异（CNV）景观，以区分恶性上皮和非恶性上皮（图1e）。骨髓细胞进一步分为单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞（图1e）。从T&NK 簇中鉴定出 CD8 + T 细胞、CD4 + T 细胞、调节性 T 细胞（Treg 细胞）和自然杀伤细胞（NK 细胞）（图 1e）。同样，来自其他 5 种癌症的细胞被分为大致相同的亚组）。值得注意的是，我们在 inDrop 平台的 scRNA-seq 数据中检测到了中性粒细胞，而在 10 × Genomics 平台的 scRNA-seq 数据中未检测到中性粒细胞。中性粒细胞非常脆弱，RNA含量低，这可能是捕获失败的主要原因。CellTrek是一个计算工具包，可以根据scRNA-seq和ST数据将单个细胞直接映射回组织切片中的空间坐标。与 ST 反卷积方法不同，该方法将 ST 坐标转移到单细胞，从而实现单细胞分辨率。我们将其应用于泛癌中质量控制的scRNA-seq和 ST 数据，以重建空间单细胞图谱。即使没有来自同一患者的相应 scRNA-seq 数据，ST 数据集仍然很大程度上被基于共嵌入结果的 scRNA-seq 数据集覆盖。由于一些细胞被重复绘制，我们最终获得了包含744,289个细胞的泛癌空间单细胞转录组图谱（图1d和g）。

2. 泛癌中的 CAF 异质性

为了比较不同癌症类型的主要细胞谱系的相似性，我们构建了系统发育树。与上皮细胞的偏向分布相比，来自不同癌症类型的成纤维细胞聚集在一起，表明成纤维细胞在不同癌症类型中具有相似的转录特征。有趣的是，源自 UCEC 的 NK 细胞和 B 细胞表现出独特的特征，这意味着不同癌症类型的 TME 可能对免疫细胞表型产生不同的影响。随后，我们研究了 6 种癌症类型的 scRNA-seq 数据集中成纤维细胞的异质性（图2a）。成纤维细胞簇的重新聚集确定了四种 CAF 亚型，以及周细胞和平滑肌细胞 (SMC)。应用 Harmony 进行批次校正后，所有局部逆辛普森指数 (LISI) 大于 1 的单元表明没有观察到明显的批次效应。CFD + 成纤维细胞显示趋化因子（CCL11、CXCL12 和 CXCL14）的高表达，与之前报道的各种类型肿瘤中的 iCAF 相似。对其标记基因的GO富集分析显示它们与机械刺激、活性氧、上皮细胞增殖、免疫系统和细胞迁移的反应相关（图2c）。POSTN + 成纤维细胞显示多个 ECM 重塑基因（MMP11、CTHRC1、COL1A1、COL1A2、COL3A1、COL10A1 和 COL11A1）的高表达水平和丰富的 ECM 特征（图 2b 和 c），这与先前报道的宫颈鳞状细胞癌（CESC）中的基质CAF（mCAF）。有趣的是，一群细胞与缺氧和典型糖酵解的反应有关（图2c），类似于报道的胰腺导管腺癌（PDAC）中的代谢CAF（meCAF）。值得注意的是，我们还发现一组细胞表现出一组细胞周期相关基因（CENPF、NUSAP1、PTTG1、STMN1、TOP2A 和 TUBA1B）的较高表达（图2b），这与之前一项 CAF 泛癌研究中的增殖性 CAF (pCAF)。BRCA 患者组织微阵列的免疫荧光进一步证实了四种 CAF 亚型的存在。接下来，我们根据 Lavie 等人总结的 CAF 功能特征，使用 AUCell 算法进一步研究了 CAF 的异质性。iCAF 在免疫相关功能中表现出最高的活性，包括补体激活、趋化因子产生和炎症反应（图2d）。此外，血管生成、伤口愈合、ECM组织调节和胶原蛋白生物合成过程等生物过程都在mCAF中丰富。正如预期的那样，meCAF 表现出高水平的糖酵解活性。有趣的是，除了细胞周期之外，pCAF还参与IFN-I的产生和肌肉收缩。

CAF 细胞特征的复杂性可归因于其高度异质性起源。除了组织驻留成纤维细胞的转化外，周细胞也是 CAF 形成的重要来源。通过 Slingshot 分析，提出了从周细胞到 iCAF 的潜在过渡途径（图 2i）。与 CAF 的其他亚型相比，iCAF 表现出最低水平的转录同质性，这可能归因于其复杂的起源。既往研究表明，周细胞向成纤维细胞的转变与癌症的侵袭和转移密切相关。GeneSwitches 分析确定了从周细胞到 iCAF 的途径中激活的多个生物过程，包括伤口愈合、细胞粘附调节、ECM、血管生成、胶原纤维组织、上皮间质转化 (EMT) 和炎症反应（图 2j）。虽然我们的数据表明源自周细胞的 CAF 是 iCAF，但仍需进一步研究以探索其可能性和潜在机制。

3. CAF的空间分布特征

为了确定 CAF 的空间分布特征，我们将其细胞亚群注释信息添加到 CellTrek 对象中。由于meCAF和pCAF的细胞比例非常低，我们首先将分析重点放在iCAF和mCAF上。以OVCA（OVCA1）和CRC（CRC1）各一个组织切片为例，我们观察到iCAFs和mCAFs高密度区域之间的空间排斥现象（图3a-d），表明CAFs的激活状态是与其在 TME 中的位置有关。为了剖析从 iCAF 高密度区域到 mCAF 高密度区域的空间表达动态，我们在 OVCA1 和 CRC1 中进行了空间轨迹分析。结果表明，细胞比例沿着轨迹逐渐变化，伴随着胶原蛋白生物合成过程、ECM组织调节、伤口愈合和血管生成等特征的逐渐增加。此外，我们的弹弓分析揭示了从 iCAF 到 mCAF 的潜在转变路径（图 2i），这与之前报道的 CAF 亚群中的谱系可塑性一致。总的来说，这些结果表明 CAF 的状态可能会受到特定TME的影响。

鲁棒排名聚合（RRA）是一种整合排名以获得综合排名列表的算法[27]。我们计算了每个组织切片中所有细胞和成纤维细胞亚群之间的空间k距离，将它们从最近到最远排序，并使用RRA算法将它们整合以获得所有细胞的综合排名。经过分析，CAF的四种亚型之间表现出最小的空间k距离，而免疫细胞亚型的排序没有显着差异（图3e-l）。为了进一步研究不同CAF亚型周围的微环境特征，距成纤维细胞空间k距离前10%内的细胞被定义为“CAF-近端细胞”，所有其他细胞被归类为“CAF-远端细胞”（图3m））。然后，通过配对 t 检验，我们比较了 CAF 近端细胞和 CAF 远端细胞之间的细胞比例。正如预期的那样，每种 CAF 亚型周围都有其他类型的 CAF 亚型丰富（图 3m）。此外，在CAF附近观察到更高密度的周细胞（图3m），这是CAF的重要来源。内皮细胞在 iCAF 和 mCAF 附近表现出丰度增加（图 3m）。这一观察结果可以通过 mCAF 的血管生成效应以及 iCAF 和 mCAF 之间潜在的转化关系来解释。值得注意的是，所有四种 CAF 亚型周围的上皮细胞比例均下降（图 3m），这意味着这些亚型距离上皮区域较远。此外，在CAFs附近观察到某些免疫细胞亚型的比例减少，包括iCAFs周围的中性粒细胞和Tregs比例减少，mCAFs附近的Tregs比例减少，以及pCAFs附近的B细胞比例降低。

4. 抗 PD1 治疗影响 iCAF 和 TME 之间的沟通

为了研究抗 PD1 疗法对 iCAF 的影响，我们分析了来自接受派姆单抗的 BRCA 患者的 31 配对治疗前和治疗中样本的公开 scRNA-seq 数据。有趣的是，在对成纤维细胞进行进一步亚聚类后，我们获得了与泛癌一致的CAF亚型结果（图5a和b）。然后，我们根据 T 细胞克隆扩增和治疗时间点对样本进行分层，并比较细胞比例的变化。由于缺乏两名患者的克隆扩增信息，他们被排除在本次分析之外。在治疗期间，与未进行克隆扩增的患者相比，进行克隆扩增的患者的癌细胞比例较低，这可能是由于具有细胞毒活性的 T 细胞数量增加（图 5e）。此外，与没有克隆扩增的患者相比，无论是治疗前还是治疗中，iCAF 的比例始终较低（图 5c-e）。值得注意的是，对于克隆扩增和非克隆扩增患者，与治疗前相比，治疗期间 iCAF 的比例没有变化。

虽然抗 PD-1 治疗后 iCAF 的比例保持不变，但它们的转录谱可能发生了变化。为了探索这种可能性，我们进行了差异表达分析。有趣的是，我们发现 Chitinase-3-Like-1 (CHI3L1) 显着上调，这是一种已知的促进 M2 巨噬细胞极化的调节因子。AUCell 分析一致表明，与之前相比，治疗期间 iCAF 促进 M2 巨噬细胞极化的能力增强（图 S 19e）。值得注意的是，治疗前和治疗期间 iCAF 的差异表达基因（DEG）在通过 NF-kB、上皮细胞增殖和 EMT 的 TNFα 信号传导中富集。同样，iCAF 中上皮细胞增殖和 EMT 的 AUCell 评分在治疗期间显着增加。此外，AUCell 分析结果表明，抗 PD1 治疗还增强了 iCAF 的补体激活功能。总体而言，这些发现表明抗 PD1 治疗会影响 iCAF 与其他细胞之间的通讯，包括促进上皮细胞增殖、EMT 和 M2 巨噬细胞极化。接下来，我们试图确定抗 PD-1 治疗之前和期间 iCAF 和免疫细胞之间通讯的差异。我们进一步将骨髓细胞分为单核细胞、巨噬细胞、LAMP3+树突状细胞（LAMP3+DC）、经典1型树突状细胞（cDC1s）和经典2型树突状细胞（cDC2s），T细胞分为CD4+T细胞、CD8+ T 细胞和 Tregs，并在 iCAF 和免疫细胞之间进行 CellChat 分析。值得注意的是，我们发现抗 PD1 治疗增强了 iCAF 促进免疫抑制微环境形成的能力。与治疗前相比，治疗期间iCAFs分泌MIF和层粘连蛋白来抑制CD8+T细胞的活化、增殖和迁移（图5f和g）。尽管与治疗前相比，iCAF 在治疗过程中下调了 TGFB3，但它们仍然可能通过过表达巨噬细胞集落刺激因子 1 (CSF-1) 来促进单核细胞存活并分化为肿瘤相关巨噬细胞（图 5g）。通过CXCL12/CXCR4轴，iCAF可能减少CD8+T细胞浸润，促进CD8+T细胞功能障碍，并增加Tregs的数量（图5g）。

讨论

在空间分析中，与其他细胞类型相比，成纤维细胞的四个亚群表现出相对更接近的空间接近度。我们发现 mCAF 附近有丰富的内皮细胞，并且它们的细胞间通讯可促进 TME 内的血管生成。虽然没有发现 CD8+T 细胞在 iCAF 附近富集，但我们观察到许多 iCAF-CD8+T 细胞在各种肿瘤类型中原位共定位，免疫荧光进一步证实了这一点。iCAF 与免疫细胞，特别是巨噬细胞和 CD8+T 细胞之间复杂的相互作用，有利于免疫抑制微环境的建立。值得注意的是，通过分析接受抗 PD-1 免疫治疗的 BRCA 患者的scRNA-seq数据，我们发现抗 PD-1 免疫治疗增强了 iCAF 促进免疫抑制微环境建立的能力。此外，基于 iCAF 标记基因构建的iCAF评分与黑色素瘤患者的免疫治疗反应之间存在显着相关性。因此，针对iCAF的靶向干预与抗 PD-1 治疗相结合，作为一种有价值的治疗方法具有广阔的前景。