ixxmu
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7 months ago 24年生信还出圈吗？24分的乳酸化告诉你这样加料！ by 生信人
2024年3月，南方医院谭万龙教授课题组在国际癌症耐药顶级杂志Drug Resistance Updates（IF=24.3）上发表题为“膀胱癌组蛋白乳酸化与顺铂耐药之间的关系单细胞分析Single-cell transcriptome analysis reveals the association between histone lactylation and cisplatin resistance in bladder cancer”的文章。首次报道了顺铂耐药BCa上皮细胞的特征，揭示了BCa中顺铂耐药上皮细胞的异质性，并阐明了乳酸化修饰在顺铂耐药中的作用。
所以热点“乳酸化”和难点“耐药”两者结合是偶然吗？万一做出来阴性，岂不是白忙一场？
漏！漏！漏！
思维还局限于“热点大于问题，一通分析期待大力出奇迹”已经是过去式；24年怎么出圈？临床问题+合理推测+时事热点才是王道！
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（一）背景
膀胱癌(Bladder Cancer，BCa)是全球十大最常见的癌症之一。其中肌层浸润性病例的5年生存率仅为20-40%，且近50%在3年内出现转移。以顺铂为基础的化疗是转移性膀胱癌的主要治疗方法，数据表明大多数患者最终会复发并产生耐药性。因此，迫切需要确定顺铂耐药的潜在因素和靶点。越来越多的证据表明，表观遗传调控在癌细胞获得顺铂耐药过程中起着关键作用，进一步深入研究顺铂耐药的表观遗传调控机制对确定顺铂耐药的潜在因素和靶点至关重要。
（二）结果
一、构建膀胱癌单细胞图谱并鉴定顺铂耐药簇（图1）
通过Seurat算法对不同的细胞簇进行注释，UMAP图可视化。提取上皮细胞并通过Seurat算法重新标记为不同簇。
Scissor算法用于整合bulk转录组表型数据和单细胞数据。利用GDSC数据库中肿瘤细胞系的批量测序数据和整合的肿瘤单细胞数据，Scissor在表簇4和表簇5中显示出显著富集的的顺铂抗性细胞（图1D）。
在各个方面进行了验证，包括DNA损伤修复、顺铂IC50、鳞状分化特征、药物解毒和对细胞死亡的耐药性。AUCell定量源自KEGG的DNA损伤反应相关基因在不同上皮簇中DNA损伤修复评分（DDRs）的比例。oncoPredict算法计算每个上皮细胞的顺铂IC50值，Scissor算法定义的顺铂抗性和敏感性上皮表型之间的顺铂IC50值。（图1E-H）
图1
二、顺铂耐药簇中的细胞通讯（图2）
顺铂耐药上皮细胞与血管内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、树突状细胞和免疫细胞表现出丰富的通讯免疫微环境中的相关（图2A-2B）。
受体-配体分析表明，在顺铂抗性上皮簇中，FN1-CD44、FN1-ITGAV_ITGB1、FN1-ITCA5_ITGGB1、COL9A2-ITGA1_ITGB1，COL9A2-CD44、ANGPTL4-SDC2、ANGPTL4-SDC3、ANGPTL3-CDH5、ANGPTR4-CDH11和ANGPTL4-ITGA5_ITGB1等分泌蛋白途径具有高度活性（图2C）。
图2
三、驱动顺铂耐药簇的转录因子的鉴定（图3；图S2）
转录因子分析解析上皮细胞群之间的异质性：SCENIC和NetAct解码顺铂耐药上皮细胞内独特激活的转录因子为YY1、YBX1、TFDP1、POLE4、SMARCA4、RAD21和HDAC2（图3A，3B）。
YY1是与其他转录因子密切相关的中心作用转录因子（图3C）。
YY1、DNMT1和HDAC2直接调节耐药亚簇marker基因（图S2A-C）。
交叉分析在转录因子YY1、YBX1和与铂耐药性机制相关靶基因之间调控网络，包括DNA损伤修复（DDR）、DNA复制、碱基切除修复、核苷酸切除修复、上皮-间充质转化（EMT）和细胞死亡相关途径（细胞凋亡、自噬、线粒体吞噬）（图3E）。
图3
四、阐明顺铂耐药簇的发展轨迹（图4）
构建肿瘤上皮细胞的伪时间发育轨迹（图4A），耐药上皮细胞占据轨迹的末端阶段，显示出高度分化状态（图4A-4B）。
已鉴定转录因子如YY1和YBX1、鳞状分化标志物KRT14和CRCT1，表达呈现出逐渐增加的趋势（图4C）；
一些糖酵解相关酶，如LDHA和LDHB，也表现为时间依赖性的表达升高（图4C），这意味着在发育过程中抗性细胞簇内的潜在代谢变化。
由YY1或YBX1调节的与顺铂耐药性相关的通路中的基因在顺铂耐药性肿瘤细胞的分化过程中经历逐渐上调（图4D）。
图4
五、顺铂耐药簇中的乳酸上调（图5）
scMetabolism分析比较顺铂敏感簇与顺铂簇代谢特性，顺铂簇中糖酵解途径活性显著增强，而三羧酸循环下调（图5A）。
量化每个肿瘤细胞的糖酵解水平后，划分为高/低糖酵解组，发现糖酵解水平与顺铂IC50呈正相关（图5B，5C）。
通过增加顺铂浓度的逐步诱导方法建立顺铂肿瘤细胞系（T24R和SW780R），发现其表现出更大的糖酵解倾向，其特征是更低的氧气消耗、更高的酸和增加的乳酸生成（图S3A；5D、5E、5F）。
观察到细胞系乳酸化水平，特别是在T24R和SW780R的组蛋白区域的乳酸化水平显著增加（图5G）。
组蛋白乳酰化最富集的形式是组蛋白H3赖氨酸18乳酰化（H3K18la），H3K18la在顺铂肿瘤细胞系中上调（图5H）。
图5
六、H3K18la促进膀胱癌中的顺铂耐药性（图6；图S4）
在不同浓度的2-DG或草酸盐中培养24小时的细胞中的乳酸构建和H3K18la水平。发现2-DG和草酸盐以浓度依赖性的方式抑制总乳酰化和H3K18la水平（图6A，6B），而Nala增加H3K18la水平（图S4A）。
注：糖酵解抑制剂2-DG和草酸盐分别靶向己糖激酶和乳酸脱氢酶，以抑制乳酸的产生，从而降低乳酸化水平。外源性添加乳酸钠（Nala）可以提高乳酸水平。
用10μM顺铂与10μM 2-DG或5μM草酸盐或15μM Nala联合处理后，使用集落形成实验评估细胞的增殖能力。发现2-DG和草酸盐与顺铂协同作用可以抑制肿瘤细胞增殖和集落形成能力，但这种抑制能力被添加Nala拮抗（图6B-C，图S4B）。
Nala对肿瘤细胞的增殖能力没有显著影响，但是可以降低肿瘤细胞对顺铂的敏感性（（图S4C-S4D）。
T24和T24R的皮下植入建立小鼠异种移植物模型。与T24相比，在相同浓度下，顺铂对T24R的抑制作用显著降低（图6H）。
顺铂与2-DG或草酸盐的联合应用显著降低植入小鼠的顺铂耐药细胞中的肿瘤生长。发现顺铂与2-DG或草酸盐的联合作用导致T24R组的肿瘤重量和体积显著降低（图6I，6J）。
免疫组织化学（IHC）显示与对照组相比，顺铂和糖酵解抑制剂的组合显著抑制H3K18la水平（图S4F）。
综上，糖酵解抑制剂可能靶向H3K18la以恢复肿瘤对顺铂的敏感性。
图6
图S4
七、H3K18la驱动顺铂耐药性中的关键转录因子（图7；图S5）
ChIP-seq在肿瘤中鉴定H3K18la调节的下游靶标，发现H3K118la在肿瘤耐药相关转录因子的启动子区富集（图7A，7B；图S5A，S5B）。
YY1和YBX1在表现出糖酵解升高的肿瘤细胞中高表达（图S5C）。
与亲本细胞相比，在顺铂上皮细胞中发现YY1和YBX1的启动子区中H3K18la的富集更显著，并且YY1和YBX1在顺铂细胞中上调（图7C-7D）。
综上，H3K18la可以激活YBX1和YY1的表达，导致肿瘤中的顺铂耐药性。
图7
图S5
八、靶向YY1/YBX1以克服膀胱癌-顺铂耐药性（图8；图S6）
建立YY1或YBX1敲低或过表达的亲本和顺铂细胞系（图8A，S6A，S6B）。发现敲低YY1或YBX1可显著抑制Nala对T24R和SW780R中顺铂耐药性的增强（图8A-B、8D、S6A-C、S6E）。
LDH表达的破坏下调H3K18la水平，抑制肿瘤亲代和顺铂细胞中的顺铂，相反，随后YY1或YBX1的过表达抵消这种作用，显著增加T24和SW780中的顺铂IC50和集落形成（图8C、8E、S6D、S6F）。
糖酵解抑制剂降低小鼠皮下肿瘤中H3K18la、YY1和YBX1的蛋白质表达（图8F）。
H3k18la的水平与YY1或YBX1的表达水平呈正相关（图8F）。
YY1或YBX1表达改变的肿瘤细胞中HNRNPU的表达水平，YY1的敲除下调HNRNPU的mRNA表达，反之亦然（图S6G）。
这些结果表明，H3K18la通过上调YY1或YBX1的表达来促进肿瘤中的顺铂耐药性。
图8图S6
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