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空间转录组技术概述 #4813

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空间转录组技术概述 by 生信漫漫学

写在开头

昨天整理的文献瘫痪后恢复行走能力的神经元研究里面，除了有单细胞数据聚类分群之外,还结合了空间转录组来查看基因表达在腰椎EESREHAB关键特征中的空间分布。

神经元亚群分类
空间分布

正好今天早上学习单细胞测序基础知识的时候看到空间转录组,那就简单整理一下笔记叭!

先立个Flag: 假如四月份能学完单细胞转录组的三大高级分析的话,五月份就开始学习空间转录组,毕竟老板开会带回来的书可不止单细胞测序hhh

内容来源联川生物《单细胞测序研究一本通 3.0》

空间转录组作用

细胞是多细胞生物的基本构成单位，其空间位置是其分子特性的关键决定因素。

了解不同组织中异质细胞的空间分布和基因表达的空间模式，有助于深入了解生理和疾病的机制。

单细胞转录组测序（scRNA）可以绘制出多细胞生物组织器官中的细胞清单，但是单细胞测序需要将细胞解离，这样会导致细胞在组织中的原始位置信息丢失，所以难以在组织架构层次绘制出详细的细胞图谱以及细胞间的关系。

这时候可以使用空间转录组来帮助理解多细胞生物的细胞和组织功能，从生理、形态、解剖背景以及空间结构中绘制细胞图谱。

空间转录组技术分类

依据通量可以将空间组学分为两类：

  • 低通量：微解剖基因表达技术、原位杂交技术和原位测序技术

  • 高通量：基于空间条形码的技术——Nanostring、10X Visium、Slide-seq、STOmics、Seq-scope、sci-Space

微解剖基因表达技术

代表技术是基于激光捕获显微切割（LCM）的Geo-seq技术以及TIVA tag技术。

Geo-seq技术是建立在激光捕获显微切割（LCM）和单细胞RNA-seq技术上的，分析小到10个单细胞组织区域的转录组。

GEO-seg简要工作流程:

  • 收集到的本使用 OCT 包埋，然后进行冷冻切片和染色。
  • 利用 LCM 收集目标细胞(保持 LCM 样品的 RNA质量是至关重要)，然后裂解细胞(SCRNA-seq）使用的温和裂解缓冲液调整以适应复杂的LCM样品)进行 RT 并使用改良的 Smart2-seq协议来扩增 cDNA，质控合格的 cDNA进行文库构建

TIVA(transcriptome in viv0analysis) tag 技术是一项能够实现活细胞空间转录组学的技术。

  • 它通过细胞穿透肽，将一个个光激活的生物素标签引入活细胞中。
  • 通过对选定的区域或单细胞进行光激活，poly(U)序列暴露出来，并与细胞 mRNA的 poly-A尾退火。
  • 之后利用链霉亲和素与标签上的生物素相结合，可以收集捕获的 mRNA，进一步用于 RNAseq。

虽然它可以应用于活体组织，但它的主要限制是其通量低，一次只能分析少数单个细胞。此外，对活组织的应用限制了它在模型系统分析中的应用。

原位杂交技术

代表技术如单分子荧光原位杂交(smFISHsingle molecule fluorescence in situhybridization)

  • 通过利用多个短的、20bp 长的低聚核苷酸探针库(每个探针通常用一个荧光团标记)，实现转录本原位定量。
  • 通过这些荧光探针在目标 RNA上的特异性积累，荧光显微镜可以将单个转录本视为衍射受限点，获得目标转录本的原位信息和定量信息。

原位测序技术

MERFlSH(multiplexed error-robustfluorescence in situ hybridization)是由 smFISH改良而来

  • 采用基于条形码的组合标记方法进行多轮杂交，以确保高水平的荧光信号亮度，同时可以检测到的大量 RNA，能够在单个细胞中鉴定数千种 RNA 的拷贝数和空间定位。他
  • 使用组合标签、连续成像等技术来提高检测通量，还通过 error-robust 编码方案,来抵消单分子标记和检测错误。

空间条形码高通量技术

① ST(spatial transcriptomics)技术

ST 技术的主要原理：

  • 将 H&E 染色后的冰冻组织切片覆盖在芯片上并成像，芯片上分布大量 spot(每个spot 含有数百万条探针)，组织透化后释放出的 mRNA 被芯片上的捕获探针捕获并标记
  • 经过 RT、CDNA 扩增和文库构后进行高通量测序后
  • 将数据回归到组织中实现整体组织的全局检测。这种方式能最大程度地保留空间信息，又能最大限度检测转录信息。

该技术目前标准的分辨率为 100 微米，也就是在一个spot内有几十个细胞。

② 10X Visium

2018年，10X Genomics 在意识到空间转录组学的巨大潜力后迅速收购了Spatial公司并对技术进行了优化，在2019年11月正式推出空间转录组学产品 Visium。

Visium 使用的芯片上每个spot的直径缩小为 55 微米，一般要求的切片厚度是10-20um，因此分辨率可以达到 1-10 个细胞。

③   DSP (GeoMx Digital Spatial Profiler)

通过将组织病理学免疫学与分子技术相结合获得多个特定目标区域中多组学靶标信息，实现对冰冻组织或石蜡组织切片上蛋白和基因信息的原位检测，DSP 技术允许在切片中选择 RO(region ofinterest)区域。

DSP 技术 mRNA 探针主要包括:

  1. 探针序列，使探针可以与目标 mRNA 进行互补结合;
  2. 索引序列，包含正向和反向 PCR 引物结合位点用于 NGS 建库过程中的序列扩增和接头连接14nt UMl序列用于丰度定量，12nt probe lD用于鉴定基因;
  3. UV连接点，连接探针序列和索引序列，并可在紫处照射的情况下断开，释放索引序列。

对于蛋白的定量，则是将探针序列替换为抗体，通过抗体识别和靶向蛋白，再通过索引序列来完成定量。正是这种依赖探针的方式降低了对 mRNA 完整度的需求，使 DSP 技术可以兼容冰冻包埋样本和石蜡包埋样本。

④华大自主研发的 STOmics "时空录组，基于 DNA纳米球技术(DNANano BalDNB)

号称可以实现同一样本在组织、细胞亚细胞、分子“四尺度”同时进行空间转录组析，该技术通过时空芯片捕获组织中的 mRNA.并通过空间条形码(Coordinate lD,CID)还原回空间位置，实现组织原位测序。

技术原理：

  • 将数十亿含有随机条形码序列(CID，用于区分不同 DNB)的单链线球状 DNA纳米球(DNB)沉积到经光刻蚀刻的经修饰的芯片上。
  • 通过华大 DNBSEQ 技术对固定在芯片上的 DNB 进行测序，得到 CID 序列构成，构建CID 与 DNB 坐标位置的一一对应关系。
  • 通过与CID杂交，在每个DNB链接分子编码(MolecularID，MID 用于区分不同转录本)和含有寡核昔酸的 PolyT序列。
  • 通过将新鲜氮气冷冻组织切片加载到芯片表面，然后进行固定、渗透捕获组织切片中的 mRNA，最后进行逆转录和扩增。收集扩增后的 CDNA 作为制备文库的模板，与CID 一起进行测序。
  • 对测序数据进行计算分析，可以实现空间分辨的转录组学研究，其分辨率为220nm(spot直径220nm，两个DNB中心点间距为 500nm)，标准 1*1cm 芯片上包含 4亿个 DNB。

写在最后

因为对空间转录组了解还不够多，所以就只能说按照联川的书籍整理一下笔记分享给大家。

不过算先开个空间转录组的小篇章叭，今年反正迟早要开始学空转的！