ixxmu
commented
5 months ago YuLab JC | 原发肺癌和远处转移的多组学特征描绘揭示了免疫抑制是具有转移性可塑性的肿瘤细胞的共同特征 by YuLabSMU
Multiomics profiling of primary lung cancers and distant metastases reveals immunosuppression as a common characteristic of tumor cells with metastatic plasticity
背景介绍：转移是癌细胞从原发肿瘤扩散到远处器官的过程，是癌症死亡的主要原因。据估计，90%的癌症死亡是由转移引起的，在过去的半个世纪里，这一情况一直如此。了解转移的潜在机制对于识别生物标志物和新的治疗靶点并最终改善患者预后至关重要。
在临床上，转移等同于晚期癌症，但转移发生的时间（分子时间）和方式（潜在的机制和播种方式）在很大程度上是未知的。
之前大多数研究主要集中在原发性肿瘤和转移瘤体细胞突变上，其他分子变化，例如体细胞拷贝数变异（SCNA），表观遗传、基因表达改变以及肿瘤免疫微环境可能发挥比较重要的作用，有必要全面描述原发性非小细胞肺癌和转移瘤之间不同层面的差别。
数据介绍：为了全面描述原发性NSCLC肿瘤和转移瘤之间分子和免疫形态的差异，研究者对8对NSCLC原发肿瘤、匹配的远处转移瘤和肿瘤邻近形态正常组织进行了多组学分析。具体而言，8例患者的样本进行全外显子组测序（WES）和RNA测序（RNA-seq）;7 例患者的样本使用甲基化芯片测定基因甲基化水平，5 例患者的样本进行了免疫组化 （IHC）， 根据多种T细胞的标志物判断T细胞的浸润情况，此外，研究者重新分析了先前发表的来自35对原发性NSCLC肿瘤和匹配脑转移瘤（Brastianos队列）的WES数据，以及来自4例广泛转移性NSCLC患者和转移性肺癌小鼠模型的RNA-seq数据，并将这些结果与TRACERx数据集中原发性NSCLC肿瘤的肿瘤内异质性（ITH）数据进行了比较。
技术路线：
文章结果：
Metastasis is a molecularly late event following the clonal expansion model
转移是遵守克隆扩增模型的分子晚期事件
研究者首先研究了 7 例患者中原发肿瘤和匹配的转移瘤之间的体细胞突变差异。发现原发肿瘤和匹配的远处转移瘤之间平均有67%的突变（图1），原发性NSCLC肿瘤和转移瘤之间的肿瘤突变负荷（TMB）相似（副图1A）。为了验证这些发现，研究者分析了来自Brastianos队列的35对原发性NSCLC和脑转移瘤的已发表WES数据。同样，原发性非小细胞肺癌肿瘤和配对转移瘤平均共有69%的突变，并且具有基本相同的TMB（副图1B）。这些数据表明，在转移发生时，这些肿瘤已经处于分子进化过程的晚期，而大多数体细胞突变已经发生。
图1：原发性肺肿瘤和配对远处转移的遗传差异。对于每位患者，左侧散点图显示了体细胞单核苷酸变异的癌细胞分数 （CCF） 值。不同颜色的变体显示不同的克隆。在原发性 （P） 和转移性 （M） 肿瘤的系统发育树中，树干和分支长度与体细胞突变的数量成正比。癌症基因突变与发育树一起显示（红色为癌基因，绿色为抑癌基因）
附图1：A图：研究者队列中7对原发肿瘤和转移瘤的TMB比较。B图：Brastianos队列中35对原发肿瘤和转移瘤的TMB比较
为了精确量化肿瘤内异质性（ITH）背景下突变谱的差异，研究者使用PyClone算法计算突变的癌细胞比例（CCF），并根据CCF计算了原发性NSCLC肿瘤与转移瘤之间的遗传距离，与TRACERx 中NSCLC研究的ITH数据相比，原发肿瘤和配对转移瘤之间的遗传距离大于同一肿瘤内空间临近的肿瘤区域之间的遗传距离，尽管绝对差异相对较小（副图2）。这表明NSCLC的肿瘤进展可能遵循克隆扩增模型，即空间临近细胞在遗传上彼此更相似。
副图2：瘤内异质性（ITH）数据集与当前研究中42对原发肿瘤和转移瘤之间遗传距离的比较。
Monoclonal seeding is the predominant mode for metastasis in NSCLC
单克隆种植是NSCLC转移的主要方式、
为了研究该NSCLC队列的转移模式，研究者使用PyClone计算了所有体细胞单核苷酸变异的CCF。如图1所示，原发性NSCLC肿瘤和配对转移性肿瘤共有的所有突变在原发肿瘤和转移瘤中均为克隆性突变（定义为与CCF最高的克隆聚集的突变）。接下来，研究者根据pigeonhole principle，通过不同克隆的CCF来推断原发瘤和转移瘤之间不同亚克隆之间的关系，推断亚克隆结构（副图3）。结果表明，在该队列NSCLC患者中，原发性NSCLC肿瘤和配对转移瘤之间仅共享单个创始克隆，并且所有亚克隆均为原发肿瘤或成对转移瘤，与单克隆/单系播种模型相一致。对先前发表的 35 对原发性 NSCLC 和转移瘤的分析显示，35 例患者中34例（97%）遵循单克隆接种模式（副图4）。此外，研究者从队列中患者 8脑转移的 3 个肿瘤区域和 Brastianos 队列中患者 PB0308 的两个脑转移的 4 个肿瘤区域获得了 WES 数据。多区域测序数据的亚克隆分析也与单克隆接种模型一致。综上所述，这些数据表明，单克隆/单系播种可能是大多数非小细胞肺癌转移的主要模式。
副图3：队列中所有肿瘤样本的亚克隆结构
椭圆形的大小与每个突变簇的癌细胞比例（CCF） 成正比。最左边的列显示了基于pigeonhole principle的突变cluster构建的最终亚克隆结构。聚类 1 表示具有最大 CCF 的创始克隆，而其他cluster则被视为子克隆。
副图4：原发肿瘤和成对转移瘤之间的成对癌细胞分数图
Brastianos队列中35对原发性肿瘤和脑转移的成对癌细胞分数图。（不同颜色的点代表属于 PyClone 估计的不同克隆cluster。不显示突变少于 5 个的cluster。
Mutational processes of shared and private mutations bvetween primary NSCLCs and paired distant metastases
原发性NSCLC和成对远处转移瘤之间共享和私有突变的突变过程
众所周知，不同的癌症类型具有不同的突变特征。然而，当NSCLC转移到不同器官时，突变过程是否发生变化尚未得到很好的研究。共享突变（原发性非小细胞肺癌原发肿瘤和转移瘤之间共有的突变）和私有突变（原发性肿瘤或转移灶特有的突变）为解决这个问题提供了独特的机会。接下来，研究者使用deconstructSigs包计算了原发性NSCLC和Brastianos队列中35例患者的不同COSMIC突变特征和配对转移的贡献，以研究不同的突变过程是否在原发性NSCLC肿瘤和转移中起作用。
如副图5所示，COSMIC特征4（与烟草暴露相关）是原发肿瘤和转移瘤的主要突变特征，反映了大多数患者有吸烟史的事实。原发性肿瘤中的其他主要突变特征包括COSMIC signature 1（与自发脱氨相关）、COSMIC signature 2（与 APOBEC 介导的过程相关）、COSMIC signature 24（暴露于黄曲霉毒素）和COSMIC signature 13（与 APOBEC 介导的过程相关），它们也是转移中的主要突变特征。
副图5：所有肿瘤样本中排名前10的突变特征的贡献度
所有样本（42 个原发肿瘤和 42 个转移瘤）中前 10 个突变特征的相对贡献。
为了进一步剖析与原发性NSCLC肿瘤和转移瘤中发生转移前早期克隆扩增相关的突变过程，研究者分析了早期突变signature（根据原发瘤和转移瘤共有突变推算）以及后期突变signature（根据原发瘤或者转移瘤特有突变推算），结果如副图6所示，其中突变signature 4是共享克隆突变中的主要突变signature，这与先前的报道一致，即与烟草致癌物暴露相关的突变通常是早期克隆突变。突变signature 4 还与转移灶特有的一小部分突变有关，另一方面，突变signature 5（病因不明，与肺癌吸烟相关）和突变signature 30（病因不明，与碱基切除修复相关）在原发瘤中贡献度排名靠前，而突变signature 2 和 13 都与 APOBEC 介导的过程相关，已成为仅在转移瘤的主要突变signature。综上所述，这些结果表明，在NSCLC的肿瘤进化过程中，不同的突变过程可能在不同的分子时间起作用。虽然吸烟相关过程可能是原发性 NSCLC 肿瘤早期克隆扩增过程中诱变的主要驱动因素，但其他机制（如自发脱氨、HR-DNA 修复和 APOBEC 介导的过程）可能在原发肿瘤和转移瘤的多种亚克隆的形成过程中发挥了更重要的作用。
副图6：主干突变signature，原发瘤突变signature, 转移瘤突变signature贡献度
Increased chromosome instability in metastases compared to paired primary tumors
与配对原发肿瘤相比，转移瘤中染色体不稳定性增加
体细胞拷贝数畸变 （SCNA） 是人类恶性肿瘤的另一个关键特征，可能会影响大量基因的表达。接下来，研究者使用基于基因的 SCNA 分析算法描绘了原发性 NSCLC 和配对远处转移瘤的全基因组 SCNA 谱，用于外显子组测序数据。如图2 A所示，平均而言，59%的SCNA事件在原发肿瘤和配对转移瘤之间共享，这表明大多数SCNA事件是这些NSCLC癌变过程中的早期分子事件。同样，对Brastianos队列中成对的原发性NSCLC肿瘤和脑转移瘤的分析也显示，原发性NSCLC和来自同一患者的转移瘤之间共享54%的SCNA事件（副图7）。
图2：a 主干、原发性特异性和转移特异性 SCNA 事件的比例。SCNA事件在基因水平上定义。具体来说，将片段 log2 比率均值分配给具有 SCNA 的每个片段中的基因，因此每个样本将具有相同数量基因的 log2 比值，以便在样本之间进行比较
副图7：原发肿瘤和配对转移瘤之间体细胞拷贝数畸变 （SCNA） 的一致性
显示了 Brastianos队列35 对原发性肿瘤和脑转移灶中每对的共享（主干，灰色）、原发性特异性（蓝色）和转移特异性（红色）SCNA 事件的比例SCNA事件在基因水平上定义。
研究者还发现原发肿瘤和配对转移瘤之间具有相似 SCNA 谱的患者不一定具有相似的体细胞突变谱（SCNA 谱与体细胞突变谱之间的一致性比的 Spearman 相关性 rho = 0.21，p = 0.19;副图8）表明SCNA和突变是这些肿瘤中独立的基因组事件。另一方面，转移瘤的SCNA负荷明显高于配对的原发肿瘤（p = 0.021）（副图9）。未发现特定的SCNAs在转移中富集。 此外，与TRACERx研究的ITH数据集相比，原发肿瘤和配对转移之间的SCNA突变谱比同一NSCLC肿瘤内空间分离的肿瘤区域之间的差异更大（p = 5.1e−11，副图9右图），再次支持NSCLC肿瘤在转移期间的克隆扩增的结论。
副图8：SCNA一致性与突变一致性的相关性
通过 Spearman 的秩级相关性评估 SCNA 谱的一致性比值（原发性肿瘤与配对转移瘤）和突变谱的一致性比值（原发肿瘤与成对转移瘤）之间的关系。一致性比定义为原发肿瘤和配对转移瘤之间的共享事件数（SCNA 事件或体细胞突变）除以同一原发肿瘤和转移瘤对中的事件总数。
副图9：左图：原发肿瘤和配对转移的 SCNA 负荷。右图：ITH数据和自测数据集总体SCNA一致性
接下来，研究者比较了原发性肿瘤和匹配转移瘤中的全基因组等位基因失衡（AI）事件。研究者首先使用了FACETS，一种被广泛接受的AI分析算法，并观察到转移瘤中AI负荷增加的趋势（副图10）。随后，研究者开发了hapLOHseq算法，用于从外显子组测序数据中识别AI。从hapLOHseq分析来看，转移瘤的AI负荷高于配对原发肿瘤，（副图11）。重要的是，大多数 AI 事件（在研究者的队列中平均为 70%，在 Brastianos 队列中为 82%）在原发性 NSCLC 肿瘤和匹配的转移瘤之间共享（副图12），这表明大多数 AI 事件发生在转移扩散之前。研究者没有观察到任何在原发性肿瘤或转移瘤中富集的特定AI事件（染色体区域）。综上所述，这些结果表明，转移瘤中可能存在更高水平的染色体不稳定性 （CIN），从而导致更多的染色体畸变。这些发现与TRACERx数据一致，即CIN水平越高，生存率越低。
副图10：FACETS计算的原发肿瘤和配对转移瘤之间的等位基因失衡（AI）负荷比较
副图11：使用hapLOHseq算法比较原发肿瘤与配对转移瘤之间的等位基因失衡 （AI） 负荷
Similar DNA methylation profiles between metastases and primary NSCLC tumors
转移瘤和原发性NSCLC肿瘤之间相似的DNA甲基化谱
研究者接下来使用R中的RnBeads包来获得CpG岛甲基化值。基于CpG岛的DNA甲基化水平，用相关距离度量（1 - Pearson相关系数）对肿瘤样本进行层次聚类。发现转移灶与其配对的原发性NSCLC肿瘤聚集，而不是与其他患者的其他转移灶聚集，这表明个体之间甲基化模式存在明显的异质性。
为了比较转移瘤和原发瘤之间甲基化的区别，研究者首先进行了基因筛选，将自己队列中所有样本（包括正常组织）的DNA甲基化和基因表达数据相关联，确定了启动子DNA甲基化与mRNA表达呈负相关（斯皮尔曼秩相关系数≤-0.5）的一系列基因，并收集了先前报道的521个与DNA甲基化相关的显著抑制（SRAM）基因，这些基因已知在NSCLC中受DNA甲基化调控，然后根据筛选的基因比较了自己队列中原发性肿瘤和配对转移瘤之间的启动子DNA甲基化水平。发现这些基因的启动子甲基化水平在原发性NSCLCs和转移性肿瘤之间具有良好的相关性。
图3：原发肿瘤和配对转移瘤之间的 DNA 甲基化相似性。a 基于所有CpG岛的DNA甲基化水平（n = 27,000）对包括正常组织在内的所有样品进行无监督聚类。b 1084 个甲基化水平与转录水平负相关的基因的启动子在原发肿瘤和转移瘤之间甲基化的相关性c 先前报道的 521 个基因的启动子 DNA 甲基化水平在原发瘤和转移瘤之间的相关性
Upregulation of metabolic pathways and downregulation of immune pathways in metastases
转移瘤中代谢途径的上调和免疫途径的下调
为了探索原发瘤和转移瘤之间在转录组层面的差别，研究者使用使用edgeR进行归一化，并使用Limma包进行差异分析，使用差异基因对原发瘤样本，转移瘤样本，正常样本进行无监督聚类，发现正常样本互相聚类在一起，与肿瘤样本分开，并根据样本来源进一步聚类，突出了组织特异性基因表达模式以及肿瘤特异性（无论原发性NSCLC或转移瘤）转录组变化，在肿瘤样本中，转移瘤总体上与其相应的原发肿瘤更相似，表明肿瘤间基因表达异质性比瘤内基因表达异质性更明显。为了探究转移相关的信号通路，研究者使用GSEA算法进行富集分析，基因集数据库使用KEGG、BioCarta以及Reactome数据库，发现转移瘤与原发性NSCLC肿瘤相比，转移瘤中有5个通路显著上调，17个通路显著下调（p < 0.01，FDR < 0.25）（图4b），在转移瘤中下调的 17 条信号通路中，有 14 条与免疫相关（图 4b）。此外，转移瘤的免疫评分显著低于原发肿瘤（附加文件2：图S18，p = 0.042）。这些模式伴随着转移瘤中的 CD3、CD4、CD8、CD20 和 PD-1 密度低于 IHC 显示的 5 例患者中的原发肿瘤（图 4c）。除了转移瘤中免疫细胞浸润的整体减少外，还观察到更高的 CD4/CD8 T 细胞比率，这可能支持转移瘤中占主导地位的免疫抑制环境（附加文件 2：图 S19）。
图4：转移中的差异信号通路和白细胞抗原的免疫组织化学评估。图a：使用高度可变基因的基因表达谱的无监督聚类。图b:转移瘤中上调和下调的信号通路。图c: 通过免疫标志物（CD3、CD4、CD8、CD20 和 PD1）的免疫组织化学 （IHC） 比较原发性 NSCLC 肿瘤和配对转移瘤之间的免疫细胞浸润。密度定义为每平方毫米每个标记的阳性细胞数。y 轴显示转移瘤中每种细胞类型密度的比率 （log2） 与配对原发性肺癌的密度之比 （log2）
副图12：原发肿瘤与配对转移瘤的免疫评分比较
为了进一步了解转移瘤中免疫相关通路的下调，使用ESTIMATE、TIMER，cibersort算法对转录组数据进行去卷积，计算免疫细胞浸润程度，发现转移瘤中ESTIMATE评分显著低于原发性肿瘤（图5），大多数免疫细胞类型的浸润在原发性肺癌中高于转移瘤，除了巨噬细胞，免疫相关途径的下调主要是由于转移瘤中免疫细胞浸润减少。
图5：原发性肺癌中的免疫细胞浸润与通过转录组图谱反卷积转移的比较。a 使用ESTIMATE通过RNA-seq数据推断整体免疫细胞浸润。b-g 免疫细胞亚群通过使用 TIMER 对 RNA-seq 数据进行反卷积来推断。y 轴表示标本中每种免疫细胞类型的比例。h 使用TIMER推断的 CD4/CD8 比率。
Immunosuppression may not be due to immune privilege
免疫抑制可能不是由于免疫豁免
由于 8 个转移性肿瘤中有 7 个位于大脑中，中枢神经系统 （CNS） 的免疫豁免可能导致免疫通路的下调。为了评估免疫抑制是否仅适用于脑转移，研究者首先专门分析了患有肝转移的患者7，发现转移瘤具有更低的免疫评分，然后研究者还分析了最近发表的具有颅外转移的未经治疗的NSCLC患者数据集，发现在4例患者中的3例中，转移性样本显示出比其原发性对应物更低的免疫评分，并且重新分析了来自人肺腺癌基因工程小鼠模型（GEMM）的4个颅外转移瘤的转录组学数据。再次发现免疫评分在转移灶中特异性降低（副图13）,总之，这些数据表明，免疫途径的下调可能是与NSCLC转移相关的常见现象，无论转移部位如何。
副图13：两个颅外转移的外部数据集的免疫评分
Genomic basis for immunosuppression in metastases
转移瘤免疫抑制的基因组学基础
如上所述，转移瘤中较高的SCNA负荷与多种癌症类型的免疫抑制有关，接下来研究者进一步评估了人类白细胞抗原（HLA）I类杂合性（LOH）的缺失，这是癌症中潜在的免疫逃逸机制，发现43例患者中有16例在原发性NSCLC和/或转移瘤中携带HLA LOH（副图14），并且发现，无论原发性还是转移性，HLA LOH都与较高的SCNA负荷有关，尤其是染色体丢失。提示HLA LOH与免疫抑制具有一定相关性，需要对更大规模的原发性转移进行进一步研究，以确定与转移瘤免疫抑制相关的特定分子特征。
副图14：原发肿瘤和/或转移灶中患有 HLA LOH 的患者
总结：
研究者从多个组学（外显子组，转录组，甲基化组）层面比较了原发瘤与转移瘤之间的差别，并确定了转移相关的COSMIC signature，以及肿瘤发生转移的模式，综合外显子组的结果以及转录组的结果，发现HLA LOH与免疫抑制相关，但是这一结论仍需要分析更多的样本加以验证。
https://mp.weixin.qq.com/s/kh8FoiNDl-DNy5hkts6ONA