蛋白质糖基化——人类蛋白质糖基化途径

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蛋白质糖基化——人类蛋白质糖基化途径 by 良兰天悯家

读文献，涨知识。今天学习了解人类蛋白质糖基化途径。

已知的糖组（glycome）是通过16种不同的糖基化途径产生的，这些途径是根据糖-蛋白质连接、与蛋白质连接的起始单糖和由至少173种不同的糖基转移酶引导的独特起始（initiating）酶来区分的（见Fig.3，或蛋白质糖基化——简介 appFig.1）。这些糖基化途径除了2种类型的脂质糖基化外，还包括14种不同类型的蛋白质糖基化，包括N -糖基化、11种O -糖基化、C -甘露糖基化和GPI锚定蛋白的生成（见蛋白质糖基化——简介 Table 1）。蛋白质糖基化涉及一系列顺序步骤，以构建特征性的寡糖结构，包括确定要糖基化的蛋白质的起始步骤、具有不同核心结构的即时核心扩展（immediate core extension）步骤、扩展（和重复）常见结构模式（common structural motifs）的延伸（elongation）/分支（branching）步骤以及终止寡糖链的封端（capping）步骤（见Fig.3）。

蛋白质糖基化的起始（Initiation of protein glycosylation）

每种类型的蛋白质糖基化的起始步骤是不同的，并由一种或多种独特的糖基转移酶调节。对于N-糖基化，由寡聚糖基转移酶类复合物（oligosaccharyltransferase (OST) complex）调节；对于GPI锚定的蛋白质，由GPI-转酰胺酶复合物（GPI–transamidase complex）调节，将预先组装的GPI锚（GPI anchor）转移到ER中选定蛋白质的C末端（见蛋白质糖基化——简介 Table 1）。173种糖基转移酶中共有47种直接启动蛋白质糖基化步骤。N-糖基化的起始和可能的POMT导向的O-甘露糖基化发生共翻译。

N-糖基化在ER中由寡糖基转移酶（OST）复合物启动，该复合物与STT3A或STT3B催化亚基组装，分别用于共翻译和后翻译的糖基化。这些亚基似乎对N-糖基体的调节起到了一定作用。OST–STT3A复合物与ER肽转运子（translocon）相关，而OST–STT3B复合物包括MAGT1或TUSC3氧化还原酶（oxidoreductase）亚基。OST–STT3B复合物似乎是释放低寡聚糖的主要来源，这些寡聚糖来源于错误折叠的N-糖蛋白的去糖基化，这些糖蛋白被溶酶体降解，并广泛存在于胞质溶胶中。

Ser/Thr和可能的Tyr的GalNAc型O-糖基化在高尔基体中由多达20种具有不同和部分重叠特异性的多肽GalNAc转移酶（GALNT）同工酶启动（注意，迄今为止只有15种被证实是活性酶），产生简单的GalNAcα1–O-Ser/Thr单糖结构，也称为癌症相关Tn抗原（cancer-associated Tn antigen）。通常GALNTs在靶蛋白中缺乏明确的受体序列基序，但它们确实表现出底物特异性的差异，并以协同的方式调节蛋白质中O-聚糖的位点和模式。有的GALNTs直接将GalNAc转移到肽，有的GALNTs仅转移到先前的GalNAc糖基化肽（指定的后续糖基化）上。后续糖基化可以发生在距离初始糖基化位点较近的范围（1-3个残基）或较远的范围（6-17个残基）内，后者由C端GalNAc结合凝集素结构域（lectin domains）介导，这是后生动物（metazoan）糖基转移酶的一个独特性质。GalNAc型O-糖蛋白组是广泛的，有3000多种人类O-糖蛋白和15000多种已鉴定的O-糖苷（O-glycosites）。对具有受损（disabled）GALNT基因的同基因细胞对（pairs of isogenic cells）的不同O-糖蛋白组的分析证实，特定细胞中GALNT的表达库决定了其O-糖蛋白组，不同的（individual）同工酶做出不同的非冗余贡献。一些GALNTs，如GALNT1和GALNT2，对O -糖蛋白组有主要贡献，而另一些GALNTs则服务于特定的蛋白质和功能角色(例如, GALNT11特异性地作用于低密度脂蛋白受体(low-density lipoprotein receptor， LDLR ))相关受体家族( LRPs )，并激活其配体结合特性) 。GalNAc型O -糖基化与其他翻译后修饰(如FAM20C Ser磷酸化，VLK Tyr磷酸化和TPST1/2 Tyr硫酸化（sulfation）)存在交叉对话（cross-talks）。

Fuc、Glc和GlcNAc类型的O-糖基化起始于内质网。这些类型的O-糖基化最突出的靶点是NOTCH受体表皮生长因子样重复序列( EGF-like repeats )。NOTCH受体O-糖基化是聚糖介导的受体功能调节中最复杂的类型之一。Fuc O-型糖基化的启动由两个POFUTs引导，其中POFUT1负责EGF重复序列，POFUT2负责相关的凝血酶敏感蛋白1型重复（thrombospondin type 1 repeats）。NOTCH中EGF重复序列的Glc型O-糖基化受到三种POGLUTs的差异调节：POGLUT1对许多NOTCH EGF重复具有广泛的特异性，而POGLUT2和POGLUT3对单个功能重要重复（NOTCH1 EGF11和NOTCH3 EGF10）具有特异性，并在不同位置糖基化（见蛋白质糖基化——简介 Table 1）。EGF重复序列的GlcNAc型O-糖基化由EOGT调节。所有这些起始酶的活性都需要折叠的重复结构域，并且受体位点具有明确的序列基序。

Man型O-型糖基化在ER中启动，并涉及至少三种不同类型的启动酶。与酵母相关的O-甘露糖基化类型由POMT1/2异聚体复合物引导。尽管酵母Man O-糖蛋白组是多样的，与GalNAc型O-糖蛋白组相似，但人POMT1/2复合物似乎选择性地靶向α-肌营养不良聚糖（α-dystroglycan）中的粘蛋白（mucin）样区域和数量非常有限的其他蛋白质。最近发现了另外两种动物O-甘露糖基化。这是由四种跨膜O-Man转移酶靶向钙粘蛋白（transmembrane O-Man transferase targeting cadherins，TMTC）驱动的，主要致力于修饰钙粘蛋白超家族，以及一种尚未报道的选择性靶向丛蛋白（plexins）和受体酪氨酸激酶c-MET和RON中发现的IPT结构域（IPT domains）的酶（见蛋白质糖基化——简介 Table 1）。

甘露糖基部分也可以连接到Trp残基上（在共有的WxxW基序中；显示为凝血酶敏感蛋白1型重复和I型细胞因子受体），称为C-甘露糖化。这种修饰是由四种dpy-19样C-Man转移酶（DPY19L）糖基转移酶驱动的，并发生在ER中，推测是共翻译的。

Xyl型O-糖基化是蛋白多糖的特征，由蛋白O-木糖转移酶1（XYLT1）和XYLT2在高尔基体中启动，这两种蛋白都具有相对明确的序列基序。在选定Ser残基处的Xyl型糖基化启动糖胺聚糖链（glycosaminoglycan chains，GAG）的生物合成。XYLT1和XYLT2是差异表达的并且具有重叠的底物特异性。蛋白聚糖的多样性是有限的，但最近一种灵敏的糖蛋白组学策略几乎使已知蛋白聚糖的数量增加了一倍。

羟基赖氨酸（HYL）-Gal O-糖基化仅限于胶原蛋白（细胞外基质的重要成分）。HYL残基由前胶原赖氨酸羟化酶( PLOD1-3 )的活性产生，随后被COLGALT1/2同工酶糖基化。这些事件发生在ER中，然后形成分泌的成熟胶原三螺旋（collagen triple helix）。PLOD3除了催化赖氨酸羟基化外，还具有半乳糖基转移酶和葡萄糖基转移酶活性（至少在体外），这表明该酶也可能参与生成胶原连接的糖链。

O-GlcNAc糖基化是一种高丰度的糖基化修饰，影响大多数胞质溶胶和核蛋白，作为营养传感器和调节信号传导、转录和细胞代谢的主开关（master switch）。胞质溶胶和细胞核中的O-GlcNAc糖基化是由单一的可溶性O-GlcNA转移酶（OGT）糖基转移酶引导的，该酶与O-GlcNAc水解酶（OGA；也称为MGEA5）结合，动态调节蛋白质上的O-Glc修饰的开/关和磷酸化。OGT包含氨基末端跨膜和四-三肽重复序列（tetra-trico-peptide repeats，TPRs），其介导蛋白质-蛋白质相互作用并协调获得底物。O-GlcNAc糖基化修饰的残基没有进一步糖基化，但具有特殊的分析（analytic）挑战，不稳定( labile )且化学计量（stoichiometry）低。

蛋白质糖基化的进一步处理(Further processing of protein glycosylation)

蛋白质糖基化的过程包括通过糖基转移酶将更多的单糖添加到增长的寡糖链中，从而导致核心延伸、延长和分支，以及糖链的最终封端（Fig.3）。核心延伸是指特定类型的蛋白质糖基化所特有的糖基化步骤和糖基转移酶。对于N-糖基化，最初连接的预先形成的N-聚糖寡糖被ER中的α-甘露糖苷酶修饰，MGATs连续添加β-GlcNAc残基产生复杂型双天线(bi-antennary)、三天线(tri-antennary)和四天线(tetra-antennary)N-聚糖核心结构。GalNAc型O-糖基化涉及四种不同的O-聚糖核心结构（核心1–核心4）。POMT1/2驱动的Man型O-糖基化涉及三种不同的核心结构（核心M1–M3）。有趣的是，TMTC引发的O-甘露糖基化似乎没有被处理，而是以Man单糖的形式出现。Xyl型O-糖基化涉及一种常见的四糖，该四糖由硫酸软骨素或硫酸乙酰肝素多糖延伸。

延长和分支生物合成步骤可能在不同类型的蛋白质糖基化中共享，因此所涉及的糖基转移酶在多种糖基化途径中发挥作用（Fig.3）。延伸主要涉及N-乙酰氨基乳糖（LacNAc 2型链Galβ1–4GlcNAc），通常以重复二糖（polyLacNAc）和分支的形式（Galβ1–4GlcNAcβ1–3(Galβ1–4GlcNAcβ1–6)Galβ14GlcNAc）。异构体二糖1型LacNAc ( Galβ1-3GlcNAc )或N，N′-二乙酰乳糖胺( LacDiNAc、GalNAcβ1-4GlcNAc)二糖也作为末端二糖存在于LacNAc聚糖的共同支架上。这些延长和分支反应大多与糖脂共享。封端步骤主要涉及用岩藻酸和唾液酸N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）修饰寡糖链的末端，并由大型唾液酸转移酶和岩藻糖基转移酶家族指导（Fig.3）。加工步骤可能对某些类型的蛋白质糖基化具有特异性（途径特异性（pathway specific）），或在几种类型之间共享（途径非特异性（pathway non-specific））。大多数途径特异性酶没有密切的同源性（paralogues），这表明这些酶的表达可以预测细胞的糖基化能力和产生的聚糖结构。这涉及参与不同类型蛋白质糖基化的起始和大多数核心延伸步骤的糖基转移酶，但有几个显著的例外：GalNAc型O-糖基化起始由20种GALNT同工酶调节；N-聚糖的三天线分支由MGAT4A和MGAT4B调节（MGAT4C的作用尚不清楚）；GalNAc型O-聚糖形成核心2或核心4 O-聚糖的分支由三种同工酶（GCNT1、GCNT3或GCNT4）介导；POFUT1介导的O-Fuc聚糖的延伸由三种同工酶（MFNG、LFNG或RFNG）调节；并且确定硫酸软骨素或硫酸乙酰肝素GAG在四糖连接体上生物合成的重要步骤分别由CSGALNACT1或CSGALNACT2和EXTL2或EXTL3控制。

被认为是途径非特异性的糖基转移酶包括17种参与延长步骤的酶(包括B3GNTs、B4GALTs、B3GALTs和B4GALNTs)，以及35种参与封端步骤的糖基转移酶(包括FUTs、ST3GALs、ST6GALs、ST6GALS和ST8SIAs以及B3GATs、A4GNT和ABO)（Fig.3）。可以说，这些糖基化途径非特异性酶造就了糖组中最大的多样性，尽管它们也产生了常见的结构支架，这可能会在糖组的不同功能结合表位方面减少这种多样性。此外，这些糖基转移酶大多属于同工酶家族，具有重叠的特性和鲜为人知的非冗余功能，这至少在一定程度上阻碍了通过分析酶表达来预测产生的聚糖结构的能力。

聚糖的侧链修饰（Side-chain modifications of glycans）

硫酸化修饰是最丰富和多样的聚糖修饰方式。有35个高尔基体硫酸转移酶参与聚糖硫酸化，只有2个硫酸转移酶( TPST1/2 )直接对酪氨酸蛋白进行硫酸化。这些磺基转移酶中的大多数用于修饰GAG，在这些大的多糖上产生的不同硫酸化模式作为蛋白质的不同结合基序，并调节广泛的基本生物学作用（FIg.3）。虽然GAGs的生物合成和硫酸化已经得到了很好的理解，但对具有生物活性的GAG基序的具体结构以及指导这些基序的硫酸基转移酶同工酶的了解仍然有限。在N-糖蛋白和O-糖蛋白上发现了一种不同类型的GAG，即硫酸角质素（keratan sulfate），它是建立在polyLacNAc重复上的。硫酸角质素的合成由GlcNAc的6-O-硫酸酯化（6-O-sulfation）在CHST6/2的作用下启动，随后由B4GALT4进行半乳糖基化，并由B3GNT7延伸，进一步对涉及CHST1/3的Gal进行6-O-硫酸酯化。据预测，约有14种硫酸基转移酶可直接硫酸化N-糖蛋白和O-糖蛋白，但这些同工酶的具体作用仅部分了解（Fig.3）。

聚糖的磷酸化调节糖基化，并作为延伸步骤进展的守门员。例如，细胞外激酶POMK磷酸化α-肌营养不良聚糖中的O-Man残基，以诱导合成精细的基质聚糖（matriglycan）——α-肌营养不良聚糖上的细胞外基质结合基序（Fig.3）。FAM20B磷酸化在形成中的四糖连接体中的Xyl残基，这种磷酸化影响由调节GAG合成的B3GALT6指导的第三个合成步骤。

唾液酸的乙酰化是一种丰富的修饰，它调节唾液酸糖蛋白与细胞受体（如唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素（sialic acid-binding immunoglobulin-like lectins，Siglecs））的相互作用。乙酰化也传递了对大多数唾液酸酶去除唾液酸的抵抗力。唾液酸乙酰化是通过CASD1对活化的Neu5Ac供体糖核苷酸进行9-O或7-O乙酰化，并通过高尔基体唾液酸转移酶将乙酰化的Neu5Ac掺入聚糖而发生的。唾液酸盐9 - O -乙酰酯酶（Sialate 9-O-acetylesterases）是NeuAc去乙酰化酶。某些病毒受体与9-O-acetyl Neu5Ac结合。因此，聚糖中唾液酸的乙酰化可能在调节与内源性受体的相互作用中发挥作用，同时也被病原体利用。

Fig.3 | Human glycosylation pathways and enzymes. 糖基化途径的全局视图，糖链的主要结构元素以及糖基转移酶和碳水化合物硫酸转移酶的指定（预测的）生物合成角色（指示的是这些酶的编码基因；请注意，目前尚未报道启动针对免疫球蛋白样、plexin、转录因子（IPT）结构域的新型O-甘露糖化的酶）（问号））。16种已知的糖基化途径被组织成主要的生物合成步骤，这些步骤对途径（起始和核心延伸）和非特异性的生物合成步骤（延长（elongation）和分支（branching），以及封端（capping））具有特异性。对于涉及同工酶的途径，列出了所有异构体（带破折号或实线）。不同蛋白质糖基化途径的背景颜色模仿起始单糖的颜色（脂质糖基化通路显示为灰色），并且这些颜色在这些途径特定的糖基化步骤中保持不变。虚线表示硫酸软骨素（chondroitin sulfate，CS）和硫酸皮肤素（dermatan sulfate，DS）或硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）在常见四糖连接体（common tetrasaccharide linker）上生物合成的替代途径。该种显示有助于作为一个综合系统（integrated system）去研究单个基因以及糖基化过程。请注意，此处图示了糖基化途径的主要结构变化特征，但并非旨在显示细胞中发现的所有结构排列（structural permutations）和变化（variations）（仅针对选定结构指示对应连接(linkages））。关于所显示的糖基化酶的转录调控及其与先天性疾病和全基因组关联研究特征的关系的信息，请参见蛋白质糖基化——简介 appFigs 1 and 2（注意，此处所示和之前使用的水平方向相比，以垂直方向呈现生物合成途径）。*由于双途径特异性（dual pathway-specificity）而在图中出现2次的转移酶。COLGALT, collagen O-Gal transferase; DPY19L, dpy-19 like C-Man transferase; EOGT, epidermal growth factor-domain specific O-GlcNAc transferase; ER, endoplasmic reticulum; GALNT, polypeptide GalNAc-transferase; GDP, guanidine diphosphate; Hyl, hydroxylysine; LacNAc, N-acetyllactosamine (Galβ1–4GlcNAc); LAcDiNAc, N,N′-Diacetyllactosamine (GalNAcβ1–4GlcNAc); LLO, lipid-linked oligosaccharide; NS, non-specific; OGT, O-GlcNAc transferase; OST, oligosaccharyltransferase; POFUT, protein O-fucosyltransferase; POGLUT, protein O-Glc transferase; POMT, protein O-Man transferase; QC, quality control; R, variable underlying core glycan; S, sulfation; TMTC, transmembrane O-Man transferase targeting cadherins (also transmembrane and tetra-trico-peptide repeat (TPR) repeat-containing protein); XYLT, protein O-Xyl transferase.

注释（Note）

Oligosaccharyltransferase (OST) complex  寡糖基转移酶（OST）复合物

A membrane protein complex in the endoplasmic reticulum that transfers an oligosaccharide from a dolichol pyrophosphate-activated donor to N-linked acceptor sequences on secreted proteins. 

Translocon  转运子

A protein complex that mediates translocation of newly synthesized polypeptides from the cytosol across the endoplasmic reticulum membrane.

Oxidoreductase  氧化还原酶

An enzyme that catalyses thioldisulphide exchange reactions. In vivo oxidoreductases are important in the oxidative protein folding that takes place in the endoplasmic reticulum. Well-known examples are PDI and eRp57.

Lectin domains  凝集素结构域

Carbohydrate-binding protein domains.

Sulfation  硫酸化

An enzymatic process that transfers a sulfo group to another molecule, for example a glycan, by modifying a hydroxyl group on a monosaccharide by addition of a sulfo group. Sulfotransferases catalyse the reaction using 3′-phospho5′-adenylyl sulfate (PAPS) as a donor.

EGF-like repeats  表皮生长因子样重复序列

Common motifs of 30–40 amino acids found in the extracellular domain of transmembrane proteins or in proteins known to be secreted. The epidermal growth factor (EGF)-like repeats include six conserved cysteines forming three disulfide bonds.

Thrombospondin type 1 repeats(TSRs)  凝血酶敏感蛋白1型重复

Common protein motifs of 50–60 amino acids (6 conserved cysteines forming 3 disulfide bonds) found on transmembrane proteins and proteins in the extracellular matrix.

Mucin  粘蛋白

A large viscous heavily O-glycosylated protein. Mucins are the most abundant macromolecule in biofluids and mucus, covering most epithelial surfaces in the body.

α-Dystroglycan  α-肌营养不良聚糖

Dystroglycan is encoded by the DAG1 gene and comprises two non-covalently-bound subunits (α and β). The extracellular α-subunit with the O-Man matriglycan provides binding to laminin, and the transmembrane β-subunit provides binding to dystrophin and the cytoskeleton.

Glycosaminoglycan chains (GAGs)  糖胺聚糖链

extended linear polysaccharides comprising repeating disaccharides.

Stoichiometry   化学计量

The fraction of a glycosylation site in a glycoprotein that is occupied by a glycan.

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1，蛋白质糖基化——简介

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