FOXP3和PD-L1可能成为化生性乳腺癌的潜在治疗靶标

FOXP3和PD-L1可能成为化生性乳腺癌的潜在治疗靶标 by 珠江肿瘤

本次分享的文章以肿瘤的罕见亚型（化生性乳腺癌）为切入点，和免疫检查点治疗热点相结合，探究该亚型从免疫治疗中获益的潜在因素。接着我们就来看看如何利用免疫指标建立肿瘤罕见亚型与免疫治疗的关系。

1.前言

化生性乳腺癌(Metaplastic breast carcinoma, MBC) 是一种罕见的乳腺癌组织学亚型，本文探索了FOXP3、PD-1/PD-L1检查点和TILs在化生性乳腺癌中的临床意义和预后价值，并证实了一部分化生性乳腺癌可能受益于免疫治疗，为化生性乳腺癌的临床治疗开辟新的治疗途径。

2.基础知识准备

1.化生性乳腺癌(Metaplastic breast carcinoma, MBC):是一种罕见的乳腺癌组织学亚型,具有较强的异质性，占所有侵袭性乳腺癌的比例低于1%，具有原发肿瘤直径较大、腋窝淋巴结转移率较低、雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）阳性率较低、术后复发转移率较高和预后较差的特点。1973年，Huvos等首次提出化生性乳腺癌的概念，是一种分化程度较低的异质性肿瘤，除导管成分外，化生性乳腺癌的不同区域还含有梭形、鳞状、软骨和骨样细胞成分。大部分化生性乳腺癌属于三阴性乳腺癌，少数患者可出现ER阳性、PR阳性和（或）人表皮生长因子受体 2（HER-2）阳性表达。

2.程序性死亡配体1 (PD-L1):主要与其受体PD-1结合，可以抑制T细胞活化，从而介导免疫抑制。

3.调节性T细胞(Tregs):一类控制体内自身免疫反应性的T细胞亚群，通过主动调节的方式抑制存在于正常机体内潜在的自身反应性T细胞的活化与增殖，从而调节免疫力。在许多疾病中，如乳腺癌、肺癌等已经发现调节性T淋巴细胞明显提高，同时也阻断抗肿瘤免疫反应从而导致死亡率上升。

4.肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)：离开血液并迁移到肿瘤区域的浸润淋巴细胞，表示机体启动了对抗肿瘤的反应，往往提示较好的临床应答和预后。根据细胞所在部位的不用，分为：肿瘤内TILs (iTILs)和间质TILs(sTILs)。

5.FOXP3：Foxp3是控制Treg细胞发育和功能的关键转录因子之一，肿瘤部位的Foxp3+Treg 可以抑制机体抗肿瘤免疫反应从而减低病人的存活率。肿瘤浸润部位Foxp3+Treg数目都与乳腺癌病人预后好坏有着高度的相关性。

6.Wnt/β-catenin信号通路：Wnt信号传导途径是由配体蛋白质Wnt和膜蛋白受体结合激发的一组多下游通道的信号转导途径。Wnt的激活需要porc的参与。当激活后的Wnt与细胞膜上的Frizzled结合，激活细胞质中的scaffold,进而激活细胞核的TCF/ LEF，使下游基因开始转录，产物包括c-MYC、c-Jun、Fra-1、cycD、WISP1等，与细胞周期相关。通路的标志分子有β-catenin。

3.文章摘要

背景：乳腺化生癌是一组异质性肿瘤，肿瘤分化为鳞状、梭形、软骨样、骨性或横纹肌样间充质成分。靶向程序性死亡配体1 (PD-L1)和免疫抑制T细胞(Tregs)的新兴免疫疗法可能对化生型乳腺癌患者有益，这些患者通常具有化疗耐药且不表达激素治疗靶点。方法:评估了大规模化生性乳腺癌队列中PD-L1和FOXP3的免疫组化表达以及肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的范围，还有生存数据。结果:与三阴性乳腺癌相比，化生型乳腺癌PD-L1阳性肿瘤细胞显著富集(P < 0.0001)，而PD-L1阳性的TILs无显著差异。化生型乳腺癌中表达FOXP3的TILs也显著增加，FOXP3阳性的肿瘤内TILs (iTILs)与不良预后结果相关(P=0.0226)。多因素分析发现FOXP3 iTILs表达状态是影响患者生存的重要独立预后因素。结论:研究结果表明FOXP3、PD-1/PD-L1检查点和TILs在化生乳腺癌中的临床意义和预后价值，并证实了一部分化生性乳腺癌可能受益于免疫的治疗。

4.背景

MBC与非MBC的三阴性乳腺癌对比预后差，对新辅助化疗的反应较差。在MBC中，有病例报告显示抗pd -1联合紫杉醇治疗的疗效异常持久。所以免疫疗法在MBC中的应用前景十分广阔。

肿瘤细胞有能力直接抑制TILs或通过招募和重新激活免疫亚群诱发免疫抑制反应。TILs是TNBC的主要预后指标。PD-L1 在肿瘤细胞上的表达可以调控抗肿瘤免疫细胞，抑制免疫反应，其表达与较差的总生存率之间存在相关性。调节性T细胞(treg)在免疫抑制中的作用是明确的。FOXP3是Tregs的关键标志物，具有免疫抑制功能。在TNBC中，FOXP3阳性Treg的增加与生存率提高有关。

在当前的研究中，作者评估了迄今为止最大的MBC队列中TILs和PD-L1和FOXP3的表达，并探讨了这些特征与患者结局之间的关系，并证实了一部分化生性乳腺癌可能受益于免疫的治疗。

5.思维导图

6.研究方法

临床队列：

使用了昆士兰大学和皇家布里斯班妇女医院的所有临床样本和数据，并将昆士兰随访队列的非化生性TNBC病例作为横断面对照队列。

1.根据WHO分型：MBC被分为混合型(1型)、鳞状型(4型)和梭形型(5型)，并在混合型病例中观察形态的数量。

2.按照肿瘤区域内TILs浸润水平及空间分布可将肿瘤划分为第一型(0-10%;冷肿瘤);第二型(20-40%)或第三型(50-90%热肿瘤)。在之前的活检部位、透热区或挤压区，要排除正常小叶周围的淋巴细胞浸润。同时满足以下要求:(1)评估应在侵袭性肿瘤的边界内进行，(2)肿瘤边界外的TILs和乳腺导管原位癌周围的TILs除外。两名病理学家独立对所有标准进行评分。

免疫组织化学：

阳性染色定义为有≥5%的细胞显示明确染色。

对于PD-L1，肿瘤细胞和TILs使用染色阳性率进行了评估。而对于FOXP3，间质TILs 和瘤内TILs通过每高能场一次计数来评估。

每个病例的组织学评分（H score）=染色强度乘以染色细胞百分比。

数据分析：

采用Prism v8.2.0进行分析。检验结果表明，显著性接受P< 0.05。采用SPSS进行多变量分析，采用正向逐步(条件LR)方法，Exp(B)的回归系数CI为95.0%。使用的参数是肿瘤大小，级别，LN(淋巴结)阳性，患者年龄，WHO类型，TILs组，形态学数量，淋巴细胞浸润。检测PD-L1肿瘤表达、PD-L1 sTILS(间质周围)表达、FOXP3 sTILS表达和FOXP3 iTILS(肿瘤内)表达。

7.结果

figure1.探究肿瘤浸润淋巴细胞在不同分组中的分布及对MBC的预后作用。

a.探究TILs在不同MBC与TNBC中的分布差异。与TNBC相比，MBCs的第3型(50-90%热肿瘤)的比例显著降低，差异具有显著性；

b.探究TILs在who分型3型中的分布差异，显示无显著相关性；

c.探究了TILs在混合型MBC中各形态数量中的分布差异，显示无显著相关性;

d.探究了TILs在混合型MBC中各种形态类型中的分布差异，显示无显著相关性；

e.通过Kaplan-Meier生存曲线评估不同比例TILs浸润的MBCs乳腺癌特异性生存分析；

f.展示了不同比例TILS浸润的MBC的形态。

结论： 与TNBC相比，MBC病例中第3型(50-90%热肿瘤)比例显著降低。TILs浸润与肿瘤类型、形态数量或形态类型之间无显著相关性。在MBC队列中，TILs含量对乳腺癌特异性生存率没有显著影响。

figure2.探究了PD-L1在不同分组中的表达及对MBC的预后意义

a-c.展示了PD-L1在不同形态的肿瘤细胞中和TILs中染色情况，在TILs中表现为强阳性；

d.探究了在MBC中肿瘤细胞与TILs之间的PD-L1染色差异，结果显示存在显著差异；

e.探究了不同TILs浸润水平的肿瘤细胞之间，在PD-L1染色组织学评分上的差异，结果显示没有统计学意义；

f.探究了不同TILs浸润水平在PD-L1染色组织学评分上的差异，结果显示TILs的浸润比例越高，评分越高；

g.探究了MBC和TNBC病例中，肿瘤细胞和TILs之间PD-L1的表达差异，结果显示在MBC中肿瘤细胞的PD-L1染色阳性率显著增加，而在TILs中则无差异；

h.探究了在肿瘤细胞中，PD-L1阳性与PD-L1阴性患者之间的生存差异，结果显示为无差异；

i.探究了不同免疫组织化学评分的患者之间的生存差异，结果为无差异；

j.探究了TILs中PD-L1阳性患者与PD-L1阴性患者之间的生存差异，结果为无差异；

k.探究了不同的PD-L1评分与不同的TILs浸润水平组合之间的生存差异，结果为无差异；

l.为所有列联分析的P值汇总：肿瘤细胞的PD-L1表达与TILs的浸润水平显著相关（p=0.0226）;TILs的PD-L1表达与不同的who分型显著相关（P=0.0374）。

Table2.在多因素分析中，使用逐步进入法筛选变量。 肿瘤细胞的PD-L1染色水平及sTILs的FOXP3染色水平，在淋巴结阳性这一变量的基础上不能增加新的预测的效应。但iTILs的FOXP3染色水平在淋巴结阳性变量基础上，仍然是显著性的预后因子（HR = 2.372, P = 0.042）。

figure3:探究了FOXP3在不同分组中的表达及对MBC的预后意义

a和b分别展示了sTILs(间质TILs) 和iTILs(瘤内TILs)的FOXP3染色情况；

c和d探究了了MBC和TNBC之间sTILs及iTILs的FOXP3染色差异，结果显示存在显著差异；

e.探究了在MBC和TNBC之间，FOXP3 sTILs表达和计数的差异；结果显示无差异；

f.g探究了在sTILs中，FOXP3 阳性与sTILs阴性，sTILs计数<20和sTILs计数>20+的生存差异，结果显无差异；

h.探究了在MBC和TNBC之间，iTILs中FOXP3的表达和计数差异；结果显示存在显著差异；

i.j分别探究了在iTILs中，FOXP3阳性与FOXP3阴性， iTILs计数<20和20+之间的生存差异，结果显示存在显著差异。

figure4.探究了WNT活性和免疫检查点标记物在不同分组的表达及对MBC预后的意义

a.使用catenin染色作为检测WNT活性的手段，探究了(i) 在MBC各个表型之间，β-catenin 的亚细胞定位的差异，结果显示存在显著差异;（ii）饼图显示，经评估的大多数MBC病例在活跃信号和不活跃信号的区域混合;(iii)显示有代表性的细胞质、膜和核catenin染色。

b.c.d探究了在三种不同亚型的MBC中，β-catenin 亚细胞定位之间的生存差异，结果显示无差异；

e.f.g探究了在不同亚细胞定位中，各个亚型MBC之间的生存差异，结果显示无差异；

h.i.j.k探究了WNT通路活性与肿瘤细胞和TILs，表达PD-L1和表达FOXP3的之间的相关性，结果显示WNT通路活性与TILs的PD-L1的表达和sTILs的FOXP3的表达相关。

8.讨论

研究结果对临床的意义：

1.MBC比TNBC更可能地出现冷肿瘤，但MBC增加了PD-L1在肿瘤中的表达，并增加了表达FOXP3的TILs的数量。临床上存在缺乏大量TILs，而高表达PD-L1的患者，这一发现支持了检查点标记染色的临床检验需要。

2.iTILsFOXP3阳性患者的生存率比iTILsFOXP3阴性的患者低。因此MBC患者可能受益于抗FOXP3治疗。

3.WNT通路活性与TILs的PD-L1的表达和sTILs的FOXP3的表达相关。MBC患者可能受益于针对PD-L1 / PD-1靶向免疫治疗。

参考文献：

[1]. Kalaw, E., et al., Metaplastic breast cancers frequently express immune checkpoint markers FOXP3 and PD-L1. Br J Cancer, 2020.

编辑：姚佳镕

校审：吕琼

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