Nature揭示肺腺癌上皮细胞状态和可塑性图谱

Nature揭示肺腺癌上皮细胞状态和可塑性图谱 by 生信人

了解早期肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)发生发展的病理生理过程对于早期制定干预策略至关重要，今天给各位介绍这一篇近期发表在Nature上的文章，该团队研究了来自16例早期LUAD和47例匹配的正常肺样本的单个上皮细胞。上皮细胞包括多种正常和癌细胞状态，通过对癌细胞特异的转录特征分析，从而发现预防和干预的潜在靶点。究竟怎么样，我们一起看看吧！

标题：An atlas of epithelial cell states and plasticity in lung adenocarcinoma

期刊：Nature（中科院1区 IF：64.8）

PMID: 38418883 DOI: 10.1038/s41586-024-07113-9

一、研究背景

由于早期筛查的普及，LUAD越来越多地在早期病理阶段被发现。然而，患者预后仍然是中等到较差的，因此需要改进早期治疗策略。解码驱动LUAD的早期事件可以确定理想八靶点。先前的研究表明，吸烟导致普遍的分子(例如KRAS突变)和免疫变化，这些变化在LUAD及其相邻的正常系统之间共享，并且与肺恶性病变和LUAD的发展密切相关。然而，特异性上皮细胞亚群或它们如何促进损伤领域，触发正常肺(NL)向癌前病变的进展以及促进LUAD发病机制尚不清楚。因此，了解LUAD起始的细胞类型特异性变化将有助于确定预防这种病态疾病的可行靶点和策略。

二、实验结果

图1.正常肺上皮和早期LUAD中恶性亚群的分析。

1、肺上皮细胞转录组全景观

该团队结合了对早期LUAD临床标本的深入scRNA测序，以及对暴露于烟草致癌物后LUAD发展的人类相关模型的跨物种分析和谱系追踪(图1a)。使用scRNA-seq研究了来自富含EPCAM的16例早期LUAD患者样本和47例NL样本的上皮细胞亚群，这些样本跨越了LUAD的地形连续体，即肿瘤邻近、肿瘤中间和肿瘤远端位置15(图1a)。此外还收集了来自同一区域的肿瘤和正常组织集，用于全外泌子组测序(WES)分析和高分辨率空间转录组学(ST)和蛋白质分析(图1a)。质控后保留246102个上皮细胞进行分析。通过整合来自推断拷贝数变异（推断CNV）、聚类分布、谱系特异性基因表达和携带KRAS^G12体细胞突变的读数的存在信息，将恶性细胞（n=17064）与其他非恶性正常细胞（n=229038）区分开来（图2b）。恶性细胞形成了14个簇（图1c），这些簇主要是患者特异性的，这意味着强烈的患者间异质性。

图2. 人类LUAD中KACs的鉴定和表征。

2、LUAD恶性转录程序

与EGFR突变LUADs (EM-LUADs)或MET突变LUADs (MM-LUADs)的恶性细胞明显不同(图1e)，KM - LUAD (KRAS wild-type - LUAD)在样本和细胞水平上表现出更多的转录组相似性(即更短的Bhattacharyya距离)。总体而言，携带KRAS^G12D突变的恶性细胞显示出分化减少，这与KM - LUAD中肺泡分化（MP31）的丧失一致。其中，来自患者P14的恶性细胞簇表现出不同水平的CNVs 15，其中富含KRAS ^G12D细胞簇携带相对较晚的CNV事件（例如，染色体1p缺失、染色体8和染色体12增加）和肺泡特征评分降低，这与减弱的分化一致（扩展数据图2g，h）。KRAS特征是基于队列中KRAS突变恶性细胞的不同表达特征得出的，其与MP30特征强烈且显著相关。

3、LUAD中的AICs

与多区域NL样本相比，LUAD中的AT2细胞总体减少（P=0.002），而AICs显示出相反的模式（P=0.02；扩展数据图第3a、b段）。AT2细胞在7名患者的多区域NL样本中，随着肿瘤接近度的增加而逐渐减少（P=0.004）。AICs是AT2-AT1细胞的发育和分化轨迹中的中介（图2a）。LUAD组织中分化程度最低的AICs的比例高于分化程度较高的AICs（分别为29%和11%）。值得注意的是，AICs被推断为向恶性细胞过渡，包括KRAS突变细胞，其相对于EGFR突变恶性细胞发育更晚（P＜2.2×10⁻¹⁶；图2a）。对AICs的进一步分析确定了具有明显高表达KRT8的亚群（图2b）。这些KACs具有增加的CDKN1A、CDKN2A、PLAUR和肿瘤标记物CLDN4的表达（图2b）。KACs分化程度也明显较低（P＜2.2×10⁻¹⁶；图2c），发育较晚（P＝1.2×10⁻¹¹）。值得注意的是，KACs转变为KRAS突变的恶性细胞，而其他AICs与向AT1细胞的分化更密切相关。相对于多区域NL组织，LUAD中非恶性上皮细胞中KACs的比例显著增加（P=2.4×10⁻⁴；图2d），且LUAD中KACs显著高于AT1、AT2或其他AIC组分（P<2.2×10⁻¹⁶；图2e）。来自患者P14的肿瘤组织的ST分析显示，KRT8在肿瘤区域（具有高CNV评分）和组织学上包括高反应性肺细胞并表现出中到低CNV评分的TAN区域中的表达增加（图2g）。且相对于肺泡细胞，KACs更接近肿瘤区域。KAC富集区的ST分析表明，KAC在肺泡实质向肿瘤细胞的转变中起中介作用。肿瘤区域NKX2-1的表达和肺泡特征显著减少（扩展数据图4b），这与KM - LUAD中肺泡分化减少一致。KAC标记物（图2b）在肿瘤区域和具有反应性肺细胞的TAN中较高，并且它们在空间上与KRAS特征重叠（图2g）。相反，其他AIC与KRAS（R=0.045；P=3.2×10−5）或肺泡（R=−0.11；P<2.2×10−16）特征之间没有相关性。总而言之，该团队研究结果表明KACs是一种与人类LUAD，特别是KM-LUAD的发病机制高度相关的中间肺泡细胞亚群。

图3. KAC 在烟草相关 KM-LUAD 发病机制中早期和肿瘤发病前的演变

4、一种与小鼠KM-LUAD有关的KAC状态

接着对来自小鼠的肺上皮细胞进行了scRNA-seq分析，其中肺谱系特异性G蛋白偶联受体a基因Gprc5a被敲除（Gprc5a^-^/^-）后，在烟草致癌物暴露后产生KM LUAD。在暴露结束时（EOE）和暴露后7个月，即KM-LUAD发作的时间点用尼古丁衍生的亚硝胺酮（NNK）或生理盐水（作为对照）处理的Gprc5a^-^/^-小鼠的肺。聚类分析揭示了不同的谱系，包括聚集在AT1和AT2细胞亚群之间并靠近肿瘤细胞的KACs。与人类细胞相似，恶性细胞表现出谱系特异性基因的低表达。同样，来自恶性集群的细胞具有高CNV评分，表达KRAS ^G12D突变，并显示出与肺泡分化丧失（Kng2和Meg3）和免疫抑制（Cd24a）相关的标记物表达增加。

获得的小鼠KAC特征在小鼠KACs和恶性细胞(P < 2.2 × 10^-16)和人LUAD (P = 1.2 × 10^-8)中显著丰富，在癌前AAHs (P = 4.3 × 10^-4)中也显著增加，相对于匹配的NL组织，侵袭性LUAD (P = 1.5 × 10^-³)进一步增加。

于是该团队对队列中的细胞与来自两项独立研究的KRAS^G12D驱动的细胞进行了整合的scRNA-seq分析。簇C5包括来自所有三项研究的细胞，具有明显高表达的KAC标记物和KAC特征本身。与正常AT2细胞相比，来自KRAS^G12D驱动的小鼠的C5细胞仍然表达更高水平的KAC特征。与这些发现一致，小鼠KAC特征与其人类对应物一样，相对于EM - LUAD，KM - LUAD的KAC和恶性细胞中显著富集（分别为P=0.04和P<2.2×10^-¹⁶）。

接着为了进一步揭示KACs的生物学特征，该团队发现GFP⁺类器官在KACs中富集。GFP⁺细胞（n=3089）几乎完全由AT2、早期肿瘤和AT2样肿瘤细胞、KACs和KAC样细胞以及少数AT1细胞组成，所有这些细胞在GFP^-组分中几乎不存在。与早期AT2样肿瘤细胞相比，从这个时间点开始的GFP⁺KACs，与癌前的形成相吻合，在相似的部分携带驱动因子KRAS^G12D突变。最后，该团队利用KRAS（G12D）抑制剂联合Cre工具鼠，最终确定KACs是KM-LUAD早期发展和烟草致癌物暴露后的中间细胞状态。

图4 KACs与AT2向KRAS突变肿瘤细胞的转变有关

三、讨论

该团队通过对早期LUAD肺的上皮细胞进行了多模式分析，发现了与KM-LUAD发病机制有关的多种恶性状态、ITH模式和细胞可塑性程序。其中，鉴定了肺泡分化程序激活后产生的肺泡中间细胞（KACs），它可以作为KM-LUAD的祖细胞。KACs在小鼠和患者样本中病变附近的正常出现区域都很明显，这表明这些细胞的早期出现可能代表“损伤场”。一个与人类癌症的发展和正常肺组织中存在的复杂突变谱有关的“损伤场”。这揭示了KACs和KRAS突变的肺肿瘤细胞之间的紧密联系和密切共享的特性，包括KRAS突变、分化减少和途径。结合对早期人类LUAD和KRAS突变肺癌模型的深入研究，提供了一个具有大量上皮细胞的图谱。这张人类和小鼠肺中上皮和恶性细胞状态的图谱强调了LUAD开始的新的细胞特异性亚群，这可能会启发目标的推导（例如，早期KRAS程序等KAC信号），以防止LUAD的启动和发展。

四、总结

这篇Nature文章通过对来自16例早期LUAD的肺上皮细胞进行转录组学分析，确定了KM-LUAD密切相关的细胞状态，最终确定了KACs是KM-LUAD早期发展和烟草致癌物暴露后的中间细胞状态，为未来早期预防和介入提供了潜在靶点。更多详情还请大家移步原文，仔细品鉴。

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