ixxmu
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5 months ago IF40+泛癌分析 单细胞和空间转录组揭示成纤维细胞肿瘤微环境 by 生信人
单细胞和空间转录组结合的泛癌分析长什么样，今天带大家看一看。
1.研究背景
肿瘤表现出广泛的异质性，癌细胞与其微环境_相互作用，形成一个复杂的生态系统。泛癌相关的成纤维细胞(CAFs)作为肿瘤微环境(TME)最突出和最丰富的细胞群之一，近年来引起了人们的极大关注。CAF与基质组分和免疫细胞的复杂相互作用在协调TME重组中起着至关重要的作用，包括血管生成、细胞外基质(ECM)重塑和免疫逃避等过程。目前，包括免疫治疗和化疗在内的大多数治疗方法在很大程度上忽视了CAFs的关键作用。近年来，单细胞转录_组学的应用揭示了许多癌症类型中CAFs的异质性，但组织分离过程中空间信息的丢失阻碍了对CAFs和TME关系的研究。因此，作者将scRNA-seq数据与ST数据进行正交整合将有助于确定CAFs的空间分布特征，并进一步剖析CAFs与TME之间的细胞通信。
2.数据来源
自测数据：对56个来自六种不同癌症病人的69个样本进行了单细胞测序。
挖掘数据：22例患者的22个组织切片的ST数据；31对接受培溴利珠单抗治疗的BRCA患者治疗前和治疗中的公开scRNA-seq数据; 从TCGA数据库中下载了黑色素瘤患者体细胞突变数据和CNV数据。
3.研究思路
图1. A.描述了研究设计的示意图。这项泛癌症研究中包括的癌症类型显示在左侧的第一张图片中，由FigDraw创建。B. scRNA-seq和ST在泛癌分析中的样本数量。C.饼图显示具有来自同一患者的相应scRNA-seq数据的ST段与那些没有此类相应scRNA-seq数据的ST段的比例。D.在scRNA-seq和ST的泛癌分析中的细胞数。E.UMAP图显示了CRC中的主要细胞类型。F. 气泡热图显示结直肠癌主要细胞类型的标记基因表达。G.用CellTrek绘制CRC空间单元图
在这项研究中，作者描绘了六种常见癌症类型的CAF情况，并描述了这些亚型的独特功能特征。作者还分析了另外三个常见肿瘤和两个新测序的罕见肿瘤的scRNA-seq数据，以扩大作者对CAF异质性的理解。通过整合scRNA-seq数据和ST数据，建立了涵盖6个肿瘤(包括744,289个细胞)的空间单细胞转录图谱，以描述CAF的空间分布特征，并描述CAF与TME之间的复杂相互作用。值得注意的是，基于炎症性CAF(ICAF)产生的评分与黑色素瘤患者对免疫治疗的反应显著相关。总之，该研究联合分析的多源数据为TME中针对CAF的治疗策略的开发提供了新的见解和指导。
4.生信方法
4.1泛癌单细胞转录组图谱的构建
单细胞数据收集: 为了建立泛癌的单细胞空间图谱，作者从56名被诊断为六种常见癌症类型之一的患者的69个样本中获得了scRNA-seq数据，以及22名患者的22个组织切片的ST数据(图1A和B)。其中，10个组织切片的ST数据具有来自同一患者的对应的scRNA-seq数据(图1C)。收集的数据包括六种癌症：BRCA、结直肠癌(CRC)、肝细胞癌(LIHC)、卵巢癌(OVCA)、前列腺癌(PRAD)和子宫内膜癌(UCEC)(图1A)。
细胞注释：为了最大限度地减少不同scRNA-seq数据集之间的批量效应，作者独立地分析了每个数据集。以结直肠癌为例，作者使用基于图的聚类方法，根据不同细胞类型的典型标记确定了七个主要簇，包括上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、T&NK细胞、B细胞、髓系细胞和肥大细胞(图1E和图1F)。使用CopyKAT估计肿瘤的单细胞拷贝数变异(CNV)，以区分恶性上皮和非恶性上皮(图1E)。
基于CellTrek的单细胞数据空间映射：CellTrek是一个计算工具包，可以根据scRNA-seq和ST数据将单个细胞直接映射回组织切片中的空间坐标。与ST去卷积方法不同，这种方法将ST坐标转移到单个细胞，从而实现单个细胞的分辨率。作者将其应用于质量控制的scRNA-seq和泛癌ST数据，以重建空间单细胞图谱。即使没有来自同一患者的相应scRNA-seq数据，基于共嵌入结果ST数据集仍在很大程度上被scRNA-seq数据集覆盖。由于一些细胞被重复定位，最终获得了包含744,289个细胞的泛癌空间单细胞转录图谱(图1D和G)。
4.2泛癌组织中CAF的异质性
Haromony矫正批次效应：作者随后在6种癌症类型的scRNA-seq数据集中研究了成纤维细胞的异质性(图2A)。成纤维细胞簇的重新聚集确定了四种CAF亚型，以及周细胞和平滑肌细胞(SMC)(图2A)。应用Harmony进行批次校正后，所有局部逆辛普森指数(LISI)大于1的细胞均未观察到明显的批次效应。CFD+成纤维细胞显示高表达趋化因子(CCL11、CXCL12和CXCL14)(图2B)，类似于先前已报道的在各种类型的肿瘤中的iCAF和PTC。
AUCell打分：作者使用AUCell算法进一步研究了CAF的异质性 (图2D)。ICAF在免疫相关功能中表现出最高的活性，包括补体激活、趋化因子产生和炎症反应(图2D)。此外，血管生成、伤口愈合、ECM组织调节和胶原生物合成过程等生物学过程都在mCAF中得到丰富(图2D)。正如预期的那样，meCAF显示出高水平的糖酵解活性(图2D)。
图2.泛癌组织中CAF的异质性。A.UMAP的曲线图显示了Harmony包对六种不同癌症类型的成纤维细胞的整合。B。差异表达分析显示每种成纤维细胞亚型上调的基因。调整后的p值 < 0.05用红色表示，而调整后的p值 ≥ 0.05用蓝色表示。C.各CAF亚型上调基因的Go富集率分析。显示AUcell在每个CAF亚型中评分的通路活动的3D热图。多种癌症类型中CAF亚型的比例。显示CAF亚型在每种癌症类型中的OR的F热图。G散点图，显示每个CAF亚型中的RSS。最大的5条规则会突出显示。MeCAF代谢途径的H-SCAP分析。一、CAF弹跳弹道分析。J-GeneSwitches分析周细胞向iCAF转化途径中途径活性的变化
SCENIC转录因子分析: 通过SCENIC分析，作者确定了CAF四个亚型中的核心motif。与炎症相关的调节蛋白CDX2和与ECM重塑相关的调节蛋白TCF12分别富含在iCAF和mCAF中(图2G)。此外，作者观察到meCAF富含KLF16 (图2G)，一种已知的代谢调节因子。最后，细胞周期相关调控子(MYBL2和E2F2)在PCAF中高度丰富(图2G)。
SCPA和scMetabolism代谢活性分析：MeCAF的代谢相关性促使作者进行SCPA分析来研究它们的代谢途径活性。正如预期的那样，糖酵解和丙酮酸在meCAF的顶端代谢途径中得到了富集(图2H)。以前的研究已经报道，CAF通过低氧TME中的糖酵解为癌细胞提供能量。这种逆Warburg效应可能是由meCAF引起的。为了进一步研究CAF的代谢重编程，作者进行了scMetabolism代谢分析，并在不同的CAF亚组中确定了与肿瘤生长相关的各种代谢重排机制。MCAF在脂肪酸生物合成中显示出更高的活性，而TCA循环在pCAF中得到了丰富。除了糖酵解，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代谢也在meCAF中得到丰富。
Slingshot单细胞轨迹分析：CAF细胞特性的复杂性可以归因于它们的高度异质性来源。除了从组织内的成纤维细胞转化外，周细胞也是形成CAF的重要来源。通过Slingshot分析，提出了从周细胞到iCAF的潜在转换途径(图2I)。与其他亚型的CAF相比，iCAF表现出最低水平的转录同源性，这可能归因于它们复杂的起源。
GeneSwitches分析发现，在从周细胞到iCAF的过程中，有多种生物学过程被激活，包括伤口愈合、细胞黏附调节、细胞外基质、血管生成、胶原纤维组织、上皮-间充质转化(EMT)和炎症反应(图2J)。虽然作者的数据表明周细胞来源的CAF是iCAF，但还需要进一步的研究来探索其可能性和潜在的机制。
4.3 CAF的空间分布特征
SPATA2空间轨迹分析：为了剖析从iCAF高密度区到mCAF高密度区的空间表达动态，作者在OVCA1和CRC1中进行了空间轨迹分析。结果表明，细胞比例沿着轨迹逐渐变化，伴随着胶原生物合成过程、ECM组织调节、伤口愈合和血管生成等特征的逐渐增加。
4.4 CAF通过旁分泌信号对TME的影响
Spatalk空间转录组细胞通讯：鉴于mCAF的高血管生成活性，作者使用Spatalk来探索mCAF与血管内皮细胞在空间背景下的相互作用。血管生成是一个复杂的分子过程，涉及内皮细胞的激活、增殖和迁移，以形成新的血管和血管系统。有趣的是，mCAF中发现的配体在内皮细胞的各种功能中发挥重要作用，包括迁移、增殖、凋亡、趋化、分化和发育。作者的分析进一步又揭示了一系列与血管生成相关的配体-受体相互作用。总之，这些发现表明，mCAF通过旁分泌信号调节内皮细胞功能，从而发挥其促血管生成的作用。
4.5抗PD1治疗影响iCAF和TME之间的通讯
CellChat单细胞通讯：为了研究抗pd1治疗对iCAF的影响，作者分析了31对接受培溴利珠单抗治疗的BRCA患者治疗前和治疗中的公开scrna-seq数据。接着为确定在抗PD-1治疗前和治疗期间，iCAF和免疫细胞之间的通信差异。作者进一步将髓系细胞分为单核细胞、巨噬细胞、LAMP_3+树突状细胞(LAMP_3+DC)、经典1型树突状细胞(CDC_1)和经典2型树突状细胞(CD_2)，T细胞分为CD_4+T细胞、CD_8+T细胞和T细胞，并对iCAF和免疫细胞进行了细胞通讯分析。最终发现抗PD1治疗增强了iCAF促进免疫抑制微环境形成的能力。与治疗前相比，iCAF在治疗期间分泌MIF和层粘连蛋白，以抑制CD8CD8T细胞的激活、增殖和迁移 (图3F和3G)。
图3. 抗PD1治疗影响了iCAF和TME之间的通讯。A.UMAP图显示了BRCA免疫治疗队列中的成纤维细胞亚群。B.热图显示成纤维细胞亚群中标记基因的表达。C.UMAP图显示成纤维细胞亚群的时间变化。D盒图显示在抗PD1治疗前有无克隆扩增的患者之间细胞比例的差异。使用非配对t检验进行统计分析；与治疗前相比，抗PD-1治疗期间iCAF细胞-细胞相互作用信号通路的差异改变。与治疗前相比，在抗PD-1治疗期间，G上调了iCAF的LRIS。与治疗前相比，H在抗PD-1治疗期间下调iCAF中的LRIS
4.6 CAF通过旁分泌信号对TME的影响
ssGSEA构建免疫治疗打分系统：基于ssGSEA算法，作者使用iCAF的前十个标记基因构建了ICAF评分，并将其应用于不同的黑色素瘤免疫治疗队列。在所有队列中，ICAF值高的患者显示总体生存期延长和无进展生存(图4A)。接下来，作者根据中位数将黑色素瘤患者分为高ICAF评分组和低ICAF评分组，并比较两组之间ICB应答者的百分比。结果显示，ICAF评分高的患者对抗PD-1治疗(图4B)和抗CTLA-4治疗(图4C)有较高的应答率。
CNV数据分析：作者观察到手臂水平的CNV负荷在高和低ICAF评分患者之间没有显著差异。然而，当作者在焦点水平检查CNV时，作者发现ICAF评分高的患者表现出较低的CNV增减负担。这种模式与之前在LIHC和CRC中报道的免疫丰富的肿瘤表型非常相似。基于这些有趣的发现，作者重点分析了黑色素瘤患者的免疫状况，发现了与ICAF评分高的黑色素瘤患者相关的几个关键特征。观察到这些患者中免疫检查点基因(PDCD1、CTLA4和LAG3)的表达和CNV扩增的频率更高(图4D)。
图4. A. Kaplan-Meier 图显示了 iCAF 评分在黑色素瘤免疫治疗队列中的预后价值。B. iCAF 评分高和低的黑色素瘤患者抗 PD1 治疗反应的百分比。c iCAF 评分高和低的黑色素瘤患者中抗 CTLA - 4 治疗反应的百分比。D. 热图显示 iCAF 评分高和低的黑色素瘤患者的免疫调节剂。e 方框图显示 iCAF 分数高和低的黑色素瘤患者免疫相关评分的比较。使用 Wilcoxon 秩和检验进行统计分析。
ESTIMATE算法: ESTIMATE算法计算的免疫评分和之前报道的免疫反应评分，包括免疫评分（Roh）、细胞溶解活性（CYT）、三级淋巴结构特征（TLS）、IFNy、扩大免疫和T细胞炎症，在iCAF评分高的患者中也被发现更高（图6E）。此外，免疫细胞和多种炎症通路（JAK-STAT、NFkB 和 TNFa）在高 iCAF 评分患者中富集。
5.总结
这篇刊发在Molecular Cancer的超高分生信文章可谓是生信泛癌分析乃至生信领域的代表作品。数据方面，作者灵活使用公共数据库，结合自测的海量单细胞数据，完成了针对某种特定细胞的泛癌分析。在方法上，作者使用了大量当今流行的单细胞数据和空间转录组数据的分析手段辅以免疫治疗、突变和生存的常见算法，此外还自创了分析细胞分布特征的相关算法。本文无论思路还是方法都值得学习采纳，这里只能着重展示部分分析流程和结果，建议读者移步原文，品鉴大师匠作。
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