教你快速开展一项有意义的非肿瘤单细胞挖掘课题

教你快速开展一项有意义的非肿瘤单细胞挖掘课题 by 生信宝库

研究背景

心肌梗死后心脏纤维化被认为是心脏病理重塑的重要组成部分。多种免疫细胞免疫细胞，尤其是巨噬细胞，被认为参与了纤维化过程，并与成纤维细胞构成微环境，促进纤维化。然而，成纤维细胞和巨噬细胞的多样性和多变性使得很难准确描绘它们之间的相互联系。

基于上述问题，本期要分享的研究通过收集并重新分析了来自 12 项不同研究的单细胞数据。随后，全面解析了心肌梗死后成纤维细胞和巨噬细胞亚群的动态变化，并确定了参与疤痕形成和胶原沉积的特定成纤维细胞和巨噬细胞亚群。研究成果题为“Macrophage and fibroblast trajectory inference and crosstalk analysis during myocardial infarction using integrated single-cell transcriptomic datasets”发表在J Transl Med (IF=6.1) 杂志上。

文献结果解读

结果一：产生 ECM 的成纤维细胞在小鼠和人类单细胞转录组中具有相似的表型

该研究首先整合两个小鼠心肌组织单细胞数据集（这些细胞是在 MI 后 1、3、5、7、14 和 28 天从小鼠心脏中提取的），从中确定了12个成纤维细胞亚群。通过分析不同时间点成纤维细胞的组成，确定了三个成纤维细胞亚群（5、9 和10），这些亚群在对照组中不存在，但在 MI 期间的急性期出现，还确定了亚群7，它在 MI 晚期增多，但在 MI 的对照期和急性期较少。进一步通过基因差异分析，富集分析和转录因子分析等确定了这四个亚群的命名和功能。5群（RCF）的生物学过程在胶原纤维组织和 ECM 组织中富集，表明该群与纤维化瘢痕形成密切相关，代表修复性心脏成纤维细胞 (RCF)。7群（基质成纤维细胞）表现出基质纤维细胞的特征，出现在梗塞期的晚期，持续存在于疤痕区域，表达 Comp 基因，并失去 αSMA 表达。9群（Ccl2+成纤维细胞）在MI 后第 1 天大量出现，在第 5天迅速减少，并且表现出与免疫相关的基因的高表达。MKi67 几乎只在10群（Mki67+ 成纤维细胞）中表达，这表明10群代表具有高增殖能力的成纤维细胞亚群。作者进一步使用人类心肌梗死后心脏组织的数据集，与在小鼠心脏中找到的成纤维细胞亚群进行比较，发现产生 ECM 的肌成纤维细胞（RCF 和基质成纤维细胞）的特征也存在于人类心脏单细胞转录组中（图1）。

结果二：Mki67+成纤维细胞在心肌梗死急性期促进 RCFs

接下来，研究者探索在MI期间不同成纤维细胞亚群的分化轨迹。首先将不同时期的成纤维细胞分为三组，MI 急性期（MI 后 1、3、5、7 天）、MI 亚急性期（MI 后 14、28 天）和对照组，进行RNA Velocity分析。使用了两种不同的模型“随机”和“动态”来估计 RNA 速度，还使用 CellRank 计算基于 RNA 速度的转换矩阵，并计算了细胞分化的速率。发现MI亚急性期成纤维细胞亚群之间的转变类似于健康心肌中观察到的成纤维细胞亚群之间的变化。接下来，重点研究了 MI 急性期成纤维细胞亚群的 RNA 速度分析，发现从 10群（Mki67+成纤维细胞）到5群（RCF）的转换，紧接着是从 RCF 到基质成纤维细胞（4群）的转换，提示MI 损伤后迅速激活的 Mki67+ 成纤维细胞转化为 RCF，并参与随后的心脏伤口愈合。还使用 CytoTRACE 评估了不同成纤维细胞亚群的分化潜力，并获得了与 RNA 速率分析相似的结果。最后，使用 Slingshot 跟踪成纤维细胞亚群的分化轨迹。将 Mki67+ 成纤维细胞设置为起点，与上述分析结果一致，RCF 来源于 Mki67+ 成纤维细胞，并作为向其他成纤维细胞亚群分化的中间状态（图2）。

结果三：CTHRC1+成纤维细胞代表慢性疾病状态下的活化成纤维细胞群

先前的结果表明Cthrc1 是RCF中的首要标记基因，为了进一步探讨CTHRC1在心脏纤维化中的基因表达水平及其与慢性疾病状态的相关性，作者从GEO数据库中获取了与小鼠心脏纤维化相关的两个单细胞数据库，包含不同治疗亚群。研究发现高表达Cthrc1的成纤维细胞群也高表达Postn，Postn 是活化成纤维细胞的经典标志物。小鼠数据集表明，在慢性疾病状态下，高表达Cthrc1的成纤维细胞群（Cthrc1+ 成纤维细胞）（作为Postn成纤维细胞的一个子集）与心脏功能恶化和纤维化加剧有关。同样，在人的心脏组织中也有类似的结果（图3）。

结果四：激活蛋白 1 是慢性疾病状态下 CTHRC1+成纤维细胞中的常见转录因子

为了更好地了解 CTHRC1+成纤维细胞的特征，作者将 CTHRC1+ 成纤维细胞与所有其他成纤维细胞亚群一起进行DEG 分析。将 TAC 小鼠数据集中上调的基因与 MI 3个月小鼠数据集中表达上调的基因进行交集，最终获得16个基因。这些交叉基因包括 Comp、Fn1、Cilp、Spp1 和 Postn，这些基因与纤维化相关。同样，与其他成纤维细胞亚群相比，DCM 和 HCM 中 CTHRC1+成纤维细胞中高表达的常见基因还包括 POSTN、COL1A1 和 COL1A2 等促纤维化基因。然后将构建的腺病毒转染到心脏成纤维细胞中，敲低细胞中的Cthrc1基因，qRT-PCR结果显示感染后Cthrc1基因被成功敲低。作者发现发现与control组相比，在Ang II刺激下，Cthrc1基因敲低细胞中胶原相关mRNA水平的表达降低。接下来使用pySCENIC分析CTHRC1+ 成纤维细胞的TF，结果发现激活蛋白-1（如JUND、JUNB和FOS）可能是CTHRC1+成纤维细胞中常见的转录因子。总之，以上结果表明，慢性疾病状态下的CTHRC1+成纤维细胞往往代表持续激活的成纤维细胞，激活蛋白-1可能参与CTHRC1+成纤维细胞的调控（图4）。

结果五：Gpnmb+Fabp5+ 巨噬细胞具有 MI 早期阶段存在的 SAM 和 SPP1hi 巨噬细胞的特征

免疫-成纤维细胞相互作用是 MI 的重要机制。为了研究 MI 后的巨噬细胞变化，作者首先从整合的小鼠单细胞数据集中提取并分析了巨噬细胞，经过基因表达分析，差异基因分析和转录因子分析，发现0群代表具有 LAM 和 SAM 相关特征的 Gpnmb+Fabp5+ 巨噬细胞。作者又整合了另外3个小鼠单细胞数据，进一步表明Gpnmb+Fabp5+巨噬细胞在 MI 的急性期迅速扩增，并在疾病的后期消失。作者进一步纳入人患病心脏数据集进行分析，结果表明，与小鼠数据集不同，人类数据集中具有 Gpnmb+Fabp5+ 巨噬细胞特征的细胞主要存在于 ICM 中，而不是 MI 心脏组织中。然而，在小鼠和人类心脏组织中，高表达 SPP1 的巨噬细胞（SPP1hi 巨噬细胞）几乎只存在于 MI 的早期阶段，而不是疾病的后期阶段（图5）。

结果六：心肌梗死急性期巨噬细胞亚群的动态转变**

同上面成纤维细胞亚群分化轨迹分析，引入RNA velocity来描绘 MI 损伤后不同阶段小鼠巨噬细胞不同亚群的动态变化。还使用 CytoTRACE 评估了不同巨噬细胞亚群的分化能力，并获得了与 RNA 速率分析相似的结果。最后，使用 Slingshot 推断分化轨迹。

结果七：细胞间通讯分析揭示了 TGFB1、TNF 和 IL1B 信号在巨噬细胞-成纤维细胞相互作用中的重要作用

最后，为了更好地了解成纤维细胞和巨噬细胞之间的相互作用，进行了细胞通讯分析。通过对小鼠与人类数据集的分析，揭示了 TGFB1、TNF 和 IL1B 信号在巨噬细胞-成纤维细胞相互作用中的重要作用。

研究思路总结

作者首先收集了已发表的小鼠和人类 scRNA-seq 数据集，涵盖广泛的心血管疾病和不同的鼠类疾病模型，包括 MI 的多个阶段、横主动脉缩窄 (TAC) 、缺血性心肌病 (ICM)、扩张型心肌病 (DCM) 和肥厚型心肌病 (HCM)；
首先研究了心肌梗死不同时间节点的小鼠心肌成纤维细胞亚群变化，通过基因差异分析，富集分析和转录因子分析等确定亚群的功能，发现一亚群与纤维化瘢痕形成密切相关，代表修复性心脏成纤维细胞 (RCF)。进一步使用人类心肌梗死后心脏组织的数据集进行验证与比较；
随后探索在MI期间不同成纤维细胞亚群的分化轨迹。使用RNA Velocity，CytoTRACE ，Slingshot三种拟时序分析方法，发现MI 损伤后迅速激活的 Mki67+ 成纤维细胞转化为 RCF，并参与随后的心脏伤口愈合；
Cthrc1 是RCF中的首要标记基因，作者探讨不同治疗亚群Cthrc1的表达，并通过免疫荧光进行验证，证明在疾病状态下，高表达Cthrc1的成纤维细胞群与心脏功能恶化和纤维化加剧有关。然后进行体外实验，Cthrc1基因敲低细胞中胶原相关mRNA水平的表达降低。接下来使用pySCENIC分析Cthrc1成纤维细胞的TF，结果发现激活蛋白-1（如JUND、JUNB和FOS）可能是CTHRC1+成纤维细胞中常见的转录因子；
作者采用与研究成纤维细胞同样的方式对巨噬细胞亚群功能和分化轨迹进行了同样的研究；
最后，进行了细胞通讯研究，揭示细胞亚群相互作用，成纤维细胞和巨噬细胞之间的相互作用。

总结

本项研究研究通过整合分析来自多项研究的单细胞数据集，涵盖了多种心血管疾病和MI 的多个阶段，通过使用RNA Velocity，CytoTRACE，Slingshot等生信算法分析了 MI 损伤后亚群的分化轨迹。同时，作者还使用 CellphoneDB 和 NicheNet 推断成纤维细胞-巨噬细胞相互作用。最后，作者使用组织免疫荧光染色和体外实验来验证CTHRC1的作用，全面描述了成纤维细胞和巨噬细胞的动态变化。

参考文献：

https://translational-medicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12967-024-05353-x

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