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3 months ago scRNA-seq携手bulk RNA-seq：性价比与科研价值的双重保障 by 新格元
Nature Medicine曾发表一篇关于转录组分析的双重奏报道。文章通过scRNA-seq与bulk RNA-seq联合应用探索与黑色素瘤患者免疫检测点阻断毒性相关的T细胞特征，发现治疗前外周血中的激活的CD4记忆T细胞丰度和TCR多样性与严重的irAE发生相关。首先对单细胞研究队列中黑色素瘤患者治疗前外周血样本进行分析,在所有亚群中只有CD4效应记忆T（TEM）细胞在治疗前血液中较高的水平与严重的irAE发展相关，将bulk RNA-seq应用于另外转移性黑色素瘤患者的外周血样本来验证，发现CIBERSORTx评估的PBMC亚群中，只有激活了的CD4TEM细胞水平与严重的irAE发育相关。同时bulk外周血中较高的TCR克隆型多样性也预示着严重irAE的发展，基于这些结果生成一个整合激活的CD4 TEM细胞丰度和整体TCR多样性的复合模型，利用bulk队列进行训练，该模型可以用于预测评估患者的严重irAE发展。
scRNA-seq可以揭示不同细胞类型之间的异质性，提供单个细胞的基因表达信息。这种检测可以帮助大家了解细胞类型的多样性、细胞发育分化命运、不同细胞类型对疾病进展的影响等。然而，单细胞转录组的技术限制导致其成本相对较高，难以获得完整的基因表达图谱。
低成本的bulk RNA-seq可以提供较完整的基因表达数据，适用于研究整个组织或细胞群体的基因表达/通路变化。然而，bulk RNA无法解析组织内的细胞异质性，一些重要的信息可能被这种“平均”所掩盖。
当前单细胞测序当之无愧的是科研界的扛把子，炙手可热的研究手段。But！单细胞数据虽然提高了信息挖掘的颗粒度，但是经常比较遗憾的是没有一些的临床信息（如治疗响应、耐药、复发信息等），因此scRNA-seq与bulk RNA-seq联合分析应运而生，既满足临床问题的研究可行性又对齐了颗粒度。
说到scRNA-seq与bulk RNA-seq数据的联合分析，就不得不提及到Scissor这个利器了，该软件于2021年发表在神刊Nature Biotechnology上，它可以整合表型或bulk组学数据，从单细胞分析中识别生物学和临床相关的细胞亚群。具体原理表述为Scissor通过首先量化每个单细胞和每个bulk样本之间的相似性来整合表型相关的bulk表达数据和单细胞数据；然后优化与样本表型相关矩阵的回归模型，从而确定表型相关的亚群。Scissor适用于计数资料（二分类）、计量资料、生存资料等多种类型的表型数据，分析得到的表型相关细胞可单独用于下游分析，如差异分析、富集分析、生存分析等，有助于发掘表型/疾病潜在的生物学机制，为细胞靶向治疗等提供更清晰的线索。
另外关于scRNA数据与大队列bulk RNA数据整合的其他算法也有一些，如BayesPrism、CIBERSORT；通过使用如BayesPrism算法整合，既可以解析大样本队列的细胞类型的比例，又能获得细胞特异的基因表达，通过使用如Scissor算法整合，可以获得与临床表型紧密相关的细胞群体。总而言之，scRNA数据和bulk RNA 数据优势互补，将单细胞和bulk数据进行有效结合，将以全新研究思路出发，会发现更多未知且精细化结果。
在这里，小编为各位小伙伴提供一些scNRA-seq联合bulkRNA-seq的研究思路。
研究思路--bulk RNA数据后期验证之路（肿瘤及非肿瘤疾病皆适用）
scRNA-seq数据分析：首先通过scRNA-seq数据分析，关注特定生物学过程（如氧化应激、缺氧、氨基酸代谢等）相关基因在不同细胞群间的表达异质性。这一步能够识别出在特定条件下具有独特表达模式的基因和细胞群。
bulk RNA数据分析：接着，使用bulk RNA测序数据进一步筛选这些特定条件下差异表达的基因，并探究其可能的转录因子调控机制和相关通路。
联合分析：将scRNA-seq和bulk RNA测序数据的结果进行联合分析，取交集，从而确认与疾病密切相关的目标基因和分子调控机制。
案例分享：干扰素刺激基因在系统性红斑狼疮（SLE）中的表达特征和调控机制研究
研究方法：分析5名SLE和3名健康对照者的35,842个PBMC细胞的scRNA-seq数据。随后，根据干扰素组数据库筛选出所有细胞群DEGs中的178个I型ISGs，并使用AUCell软件包计算ISGs活性。为了确定系统性红斑狼疮患者的PBMCs和肾脏中是否存在共同的ISG特征，我们分析了GEO数据库中狼疮肾炎（LN）患者的肾脏转录组数据。我们使用MRL/lpr小鼠模型来验证我们的研究结果。
结果：发现系统性红斑狼疮患者的单核细胞、B细胞、树突状细胞和粒细胞显著增加，而T细胞亚群显著减少。中性粒细胞和低密度粒细胞（LDGs）的ISG活性最高。GO和通路富集分析表明，DEGs主要集中在白细胞活化、细胞分泌和病原体感染方面。31个常见的ISG在PBMCs和肾脏中均有表达；这些ISG在中性粒细胞和LDGs中也最为活跃。研究发现，PLSCR1、TCF4、IRF9和STAT1等转录因子与ISGs的表达有关。同样，我们在MRL/lpr小鼠的肾脏中发现了粒细胞浸润。粒细胞抑制剂Avacopan可减少粒细胞浸润并逆转MRL/lpr小鼠的肾脏状况。
研究思路--bulk RNA数据后期验证之路（更适用于肿瘤研究的预后分析）
scRNA-seq数据分析：通过scRNA-seq数据分析，筛选与疾病相关的目标细胞群和目标基因。这一步能够揭示在疾病状态下具有特定表达模式的细胞亚群和关键基因。
bulk RNA数据分析：利用已有的bulk RNA数据（可能来自大型临床队列或TCGA数据库），进一步探究目标基因的预后价值和临床意义。这一步能够帮助我们理解这些基因在疾病进展、转移、复发等方面的作用，以及它们作为潜在治疗靶点的可能性。
临床应用：基于这些发现，可以进一步开发新的诊断标志物、预后指标或治疗策略，为临床应用提供有力支持。
案例分享：scRNA和Bulk-RNA测序数据分析PD-1靶向治疗前后肿瘤细胞间通讯，探讨免疫检查点抑制剂的应答或耐药机制
研究方法：本研究分析抗PD-1疗法前后采集的样本的scRNA-seq和bulk RNA测序数据。通过细胞-细胞相互作用分析，确定治疗前应答者和非应答者之间的差异，以及应答者和非应答者从治疗前到治疗后状态变化的相对差异，最终研究抗PD-1疗法应答和耐药的具体机制。bulkRNA数据被用来验证我们的结果。此外，还分析了应答者和非应答者特定细胞类型中配体/受体的进化轨迹。
结果：根据应答者和非应答者的预处理数据，我们确定了几种不同的细胞-细胞相互作用，如WNT5A-PTPRK、EGFR-AREG、AXL-GAS6和ACKR3-CXCL12。此外，在SELE-PSGL-1、CXCR3-CCL19、CCL4-SLC7A1、CXCL12-CXCR3、表皮生长因子受体-AREG、THBS1-a3b1复合物、TNF-TNFRSF1A、TNF-FAS和TNFSF10-TNFRSF10D相互作用中，应答者和非应答者从治疗前到治疗后状态的变化存在相对差异。在利用配体/受体基因对肿瘤特异性衰竭CD8 T细胞进行的轨迹分析中，我们发现了一组T细胞，它们呈现出不同的配体/受体表达模式。它们高度表达HAVCR2和KLRC1等抑制性基因、GZMB和FASLG等细胞毒性基因以及组织驻留相关基因CCL5。这些细胞在接受抗PD-1治疗后，生存相关基因和组织驻留相关基因，如热休克蛋白基因和白细胞介素-7受体（IL-7R）、CACYBP和IFITM3基因的表达均有所增加。这些结果揭示了抗PD-1治疗反应的机制，为改进免疫疗法的潜在策略提供了丰富的线索。
研究思路--bulk RNA-seq数据的前期探索之路（肿瘤及非肿瘤疾病皆适用）
bulk RNA-seq数据分析：从全局水平筛选与疾病相关的差异表达基因、关键通路和可能的细胞群。这一步能够提供对疾病整体表达谱的初步认识。
scRNA-seq数据分析：进一步验证和细化在bulk RNA数据分析中发现的差异表达基因和通路。通过scRNA-seq数据，可以更加精细地分析不同细胞类型或亚群中的基因表达情况，以及细胞间互作和细胞分化等过程。
探究分子机制：结合bulk RNA和scRNA-seq数据，可以深入探究目标细胞群如何影响疾病的发生和发展，包括分子信号通路、基因调控网络等。
案例分享：类风湿性关节炎（RA）、系统性红斑狼疮（SLE）和原发性干燥综合征（pSS）外周血中巨核细胞共同扩张
研究方法：分析119名未经治疗的患者（41名RA、38名pSS、28名SLE和12名多自身免疫性疾病）和20名健康对照者的PBMCs中生物过程、转录因子和基于解旋的免疫细胞类型的bulk RNA-seq数据。为了进一步确定外周血单核细胞上的免疫细胞亚群，还进行了scRNA-seq和流式细胞术。
结果：在RA、SLE、pSS和多发性自身免疫中发现了与核小体组装和止血相关的类似转录谱和共同基因表达特征。不同的TF组合和基因调控网络主要富集于造血系统。上调的细胞系特异性TF PBX1、GATA1、TAL1和GFI1B 显示了巨核细胞扩增的基因表达特征。基于基因表达的细胞类型富集显示巨核细胞组成的升高，CD41b+CD42b+和CD41b+CD61+巨核细胞的扩增。在scRNA-seq数据中，MK由TFs PBX1/GATA1/TAL1和前T细胞抗原受体基因PTCRA定义。在MKs中观察到细胞异质性和独特的免疫亚群，其抗原呈递功能丰富。
最后，需要注意的是，以上三种研究思路并不是孤立的，它们可以相互补充和结合使用，以获得更加全面和深入的疾病相关知识和分子机制。此外，在实际研究过程中，还需要根据具体的研究问题和数据类型进行灵活调整和优化。
1.Lozano, Alexander X et al. “T cell characteristics associated with toxicity to immune checkpoint blockade in patients with melanoma.” Nature medicine vol. 28,2 (2022): 353-362.
2.Sun D, Guan X, et al. Identifying phenotype-associated subpopulations by integrating bulk and single-cell sequencing data. Nat Biotechnol. 2022 Apr;40(4):527-538. doi: 10.1038/s41587-021-01091-3. Epub 2021 Nov 11. PMID: 34764492;
3.Deng, Yiyao et al. “Expression characteristics of interferon-stimulated genes and possible regulatory mechanisms in lupus patients using transcriptomics analyses.” EBioMedicine vol. 70 (2021): 103477. doi:10.1016/j.ebiom.2021.103477
4.Jiang, Yi-Quan et al. “Investigating Mechanisms of Response or Resistance to Immune Checkpoint Inhibitors by Analyzing Cell-Cell Communications in Tumors Before and After Programmed Cell Death-1 (PD-1) Targeted Therapy: An Integrative Analysis Using Single-cell RNA and Bulk-RNA Sequencing Data.” Oncoimmunology vol. 10,1 1908010. 2 Apr. 2021, doi:10.1080/2162402X.2021.1908010
5.Wang, Yukai et al. “Rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus and primary Sjögren's syndrome shared megakaryocyte expansion in peripheral blood.” Annals of the rheumatic diseases vol. 81,3 (2022): 379-385. doi:10.1136/annrheumdis-2021-220066
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