ixxmu
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4 months ago 单细胞测序+空间转录组描绘从癌前病变到浸润性肺腺癌的动态演变 by 生信菜鸟团
文章信息
英文标题：Delineating the dynamic evolution from preneoplasia to invasive lung adenocarcinoma by integrating single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics
期刊：Exp Mol Med. Epub 2022 Nov 25.
影响因子：1区12.8
DOI: 10.1038/s12276-022-00896-9.
研究领域：单细胞
单细胞RNA测序数据GSE189357；
空间转录组数据GSE189487。很好有数据，直播复现备选文章。
文献概述
背景：肺腺癌（LUAD）从原位腺癌（AIS）到微浸润性腺癌（MIA）和随后的浸润性腺癌（IAC）的动态和顺序过程中涉及的细胞生态学和空间生态位尚未阐明。这篇文章对单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学（ST）进行了综合分析，以表征LUAD侵袭轨迹的细胞图谱。UBE2C+癌细胞亚群在LUAD侵袭过程中不断增加，IAC显著升高，其空间分布在IAC的外周癌区，代表了更恶性的表型。肥大细胞、单核细胞和淋巴内皮细胞持续减少，与侵袭性LUAD的整个过程有关，伴随着NK细胞和MALT B细胞从AIS到MIA的增加，以及Tregs和分泌型B细胞从MIA到IAC的增加。AIS中癌细胞、NK细胞和肥大细胞共定位在癌症区域；IAC中，Tregs与癌细胞共定位。最后，癌细胞与TME细胞诱导的TGF-β信号的组成型激活之间的通讯和相互作用参与了IAC的侵袭。
文献内容
1.使用scRNA-seq鉴定LUAD侵袭过程中LUAD中的细胞亚型和差异表达基因
首先收集了9个LUAD样本，包括3个AIS、3个MIA和3个IAC样本。
通过scRNA-seq共获得115246个细胞，其中37,143个来自AIS的细胞（32.2%），来自MIA的30,909个细胞（26.8%）和来自IAC的47,194个细胞（41.0%），分为25个亚群。
分为从C1到C10，看起来来源于浸润性腺癌（IAC）的细胞比较多。
六种主要细胞类型包括上皮细胞（EPCAM和SCGB1A1）、T/NK细胞（CD3D、NKG7、GZMK和GNLY）、B细胞（CD79A、JCHAIN和IGHG1）、髓系细胞（LYZ、TPSB2、AIF1、HLA-DRA、HLA-DRB1和CPA3）、内皮细胞（CLDN5）和成纤维细胞（COL1A1和DCN）。
IAC和AIS（I/A）中大约一半的上调DEG已经在MIA和AIS（M/A）组中检测到。DEGs的PCA显示MIA和IAC在转录组水平上非常接近。进一步的分析揭示了LUAD三个不同阶段的富集细胞类型。
细胞类型特异性转录变化有助于LUAD的侵袭性发展，并且AIS向MIA的转变是LUAD早期侵袭的关键过程。
2.UBE2C+细胞群有助于启动LUAD侵袭过程
确认启动LUAD侵袭的关键癌细胞亚群
将上皮细胞（12,879）进一步重聚类为8个亚群（Epi-C0-Epi-C7），包括4个癌细胞亚群[Clara样癌细胞（Epi-C1），TM4SF1+癌细胞（Epi-C0），CRABP2 +癌细胞（Epi-C3）和UBE2C+癌细胞（Epi-C6）]和4个正常肺上皮细胞亚群[肺泡I型细胞（AT1， Epi-C2）、肺泡II型细胞（AT2、Epi-C5）、Clara细胞（Epi-C7）和纤毛细胞（Epi-C4）]。
与Clara样癌细胞（Epi-C1）和CRABP2+癌细胞（Epi-C3）相比，TM4SF1+（Epi-C0）和UBE2C+（Epi-C6）癌细胞的比例在LUAD侵袭过程中不断增加，在IAC中显著升高，尤其是UBE2C+亚型。
使用ssGSEA在TCGA-LUAD数据库中验证了UBE2C+癌细胞（Epi-C6）作为预测LUAD预后的生物标志物。UBE2C+癌细胞（Epi-C6）主要富集以下基因集：MYC靶点V1、细胞周期、AKT和TGF-β信号通路等基因集，可能通过这些途径促进癌症的进展。
SCENIC分析。
CNV和DEG分析均证实了癌细胞的恶性特征。
以AT2细胞为根，发现细胞首先发展成Epi-C1，然后CRABP2+癌细胞（Epi-C3）和TM4SF1+癌细胞（Epi-C0），最后分化为最差的癌细胞类型和最终状态UBE2C+癌细胞（Epi-C6）。Clara细胞（Epi-C7）可以转分化为Clara样癌细胞（Epi-C1），然后转分化为其他两种癌细胞类型（Epi-C0和Epi-C3），而UBE2C+癌细胞（Epi-C6）仍然是该轨迹中分化程度最低的癌细胞类型。
IF染色显示LUAD中Clara样癌细胞（Epi-C1）和UBE2C+癌细胞（Epi-C6）在三个不同阶段共存，LUAD可能起源于Clara细胞和AT2细胞，UBE2C+癌细胞亚群是LUAD的终末细胞类型。
UBE2C表达水平在LUAD的三个阶段逐渐升高。UBE2C高表达的患者无进展生存期和总生存期较差。
UBE2C介导LUAD细胞的增殖和转移。
3.LUAD侵袭中不同TME细胞亚群
通过聚类分析对T/NK细胞和髓系细胞进行细分亚群。如图所示。T/NK细胞亚型包括2种CD4+T 细胞亚型（T/NK-C0：LTB+和C2：CXCL13+）、2种CD8+T 细胞亚型（C1：GZMK+和C3：CCL4L2+）、2种NK细胞亚型（C4：GNLY+ 和C5：NKG7+）、1种Tregs亚型C6和成纤维细胞样T细胞亚型（C7：HSPA1B+）。
10种髓系细胞亚型，包括2种肥大细胞亚型（Mye-C0：TPSB2+和Mye-C9：CPA3+）、2种巨噬细胞亚型（C1：CCL3L1+ 和C2：FABP4+）、2种树突状细胞亚型（C4：S100B+和C8：TXN+）、2种粒细胞亚型（C3：GOS2+和C5：S100A9+）、单核细胞亚型（C7：FCN1+）和增殖亚型C6。
肥大细胞（Mye-C0：TPSB2+）和单核细胞（Mye-C7：FCN1+）的百分比从AIS和MIA逐渐持续下降到IAC。NK细胞的百分比（T/NK-C4：GNLY+）仅从AIS增加到MIA，而Tregs（T/NK-C6：FOXP3 +）从MIA到IAC显著升高。
RNA-seq验证。
GSVA分析：细胞周期和细胞生长或增殖相关通路，包括PI3K/AKT/MTOR信号传导、G2M检查点、E2F靶点和MYC，在NK（C4：GNLY+）和Tregs（C6：FOXP3+）中高度富集；Hedgehog，WNTβ-catenin和干扰素信号在肥大细胞（Mye-C0：TPSB2+）和单核细胞（Mye-C7：FCN1+）中明显。
因此，可能是Tregs增加和单核细胞减少介导的肿瘤相关通路的激活促进了早期LUAD侵袭。
在8个B细胞亚型中，5个内皮亚型和7个成纤维细胞亚型。MALT B细胞的比例（C4：IGHD+）从AIS到MIA/IAC明显减少，分泌型B细胞的比例（C7：GZMB +）从MIA到IAC显著增加。
淋巴内皮细胞（End-C4：PDPN+）的比例从AIS到IAC不断降低，而与AIS和MIA相比，IAC中癌症相关成纤维细胞（C1）的比例显著降低。
肥大细胞（Mye-C0）、单核细胞（Mye-C7）和淋巴内皮细胞（End-C4）的持续减少可能与LUAD的整个侵袭过程有关。在侵袭性LUAD的早期从AIS到MIA，NK细胞（C4）和MALT B细胞（B-C4）增加；在侵袭性 LUAD（MIA 至 IAC）的晚期，Tregs （T/NK-C6）和分泌型B细胞 （B-C7） 增加。
4.癌细胞和TME细胞之间的相互作用诱导IAC中TGF-β信号传导的激活
CellChat分析揭示了LUAD细胞之间的十大相互作用途径，TGF-β通路因其在癌症侵袭和转移中的关键作用而被进一步选择用于下游分析。在AIS和MIA中未观察到癌细胞和TME细胞之间通过TGF-β信号转导的通信，但这种相互作用在IAC中显著加强，尤其是在NK、肥大和MALT B细胞中。
在LUAD的不同阶段，癌细胞和TME细胞之间TGF-β信号转导的这种差异相互作用可能在很大程度上归因于TGF-β配体或受体在不同细胞类型中的差异表达。
在AIS和MIA中，癌细胞和TME细胞表达低水平的TGF-β配体。在IAC中，TGF-β配体的水平在癌细胞和TME细胞中均广泛上调，表明自分泌和旁分泌机制可能同时促进IAC中癌细胞和TME细胞之间TGF-β信号转导的组成型通讯。
在早期阶段，它作为肿瘤抑制途径抑制细胞生长，而在后期阶段，TGF-β促进侵袭和转移。
与AIS和MIA相比，下游靶向基因的表达水平以及TGF-β通路的下游因子p-SMAD2在IAC中高度激活。
使用NicheNet来探索LUAD三个阶段的细胞间通信。TGF-β通路相关基因主要在癌症和NK细胞中表达，这与CellChat的预测结果一致。
TGF-β通路通讯主要通过LUAD中ACVRL1、TGFBR1和TGFBR2的表达来实现。TGF-β通路的下游靶基因和下游基因（包括SMAD3、SMAD6和SMAD7）的表达水平在LUAD的三个阶段均高度激活。
5.Tregs在癌症区域的空间分布介导LUAD侵袭
六个样本（AIS：TD5，TD8；MIA：TD3、TD6；IAC：TD1，TD2）进一步进行ST分析。基于HE染色注释了切片的不同形态区域，并将样品分为四个不同的组织学区域，包括癌症区、正常上皮区、基质区和淋巴区。
TD8样本中TM4SF1+癌细胞（Epi-C0），NK细胞的2个亚型（T/NK-C4：GNLY和T/NK-C5：NKG7）和肥大细胞（Mye-C0：TPSB2）共定位在癌症区域，而Tregs（T/NK-C6：FOXP3）未在癌症区域发现。
随着LUAD进展到IAC阶段，Tregs广泛浸润到癌症区域。
为了检查ST数据中的个体差异，通过Spearman相关性量化了每个区域的点。
通过比较癌症中的脉管系统区域与AIS和IAC样本中的正常区域，IAC的癌症脉管系统区域在H&E中呈现出更明显的血管数量和VEGFs的更高表达水平。相反，AIS正常区和癌性脉管系统区域之间的血管密度和VEGFs表达水平均未产生明显差异。血管生成可能显著促进LUAD的侵袭过程。
使用配对的scRNA-seq数据对空间转录组数据进行了RCTD方法。在两个AIS标本中均鉴定出Clara样癌细胞，作为早期LUAD的恶性程度较低的癌细胞类型。
当LUAD进展到IAC阶段时，RCTD数据显示UBE2C+癌细胞浸润癌症区域。将单细胞测序数据中的每个细胞基因特征映射到每个空间点，在AIS、MIA和IAC中发现了TM4SF1+癌细胞。在AIS中，除TM4SF1+癌细胞外，其余癌细胞主要为Clara样癌细胞，且此类细胞的生物学行为相对温和。然而，在IAC中，最恶性的 UBE2C+癌细胞逐渐占主导地位。
综上所述，随着LUAD从癌前病变为IAC，Tregs在癌症区域的空间上被募集，而NK细胞和肥大细胞浸润从该区域消失。癌症血管中的异常在LUAD从AIS到IAC的侵袭中起着重要作用。
6.外周癌区比ST分析的中枢癌区更活跃
为了揭示scRNA-seq鉴定的四个癌症亚群的空间分布和生物学意义，通过ST将癌症区域重新聚类。
在TD8的AIS样品中，切片中富含癌症的区域被进一步划分为转录相关的亚区，由中心区（区域1，黑色）和外围区（区域0，红色）组成。Clara样癌细胞（Epi-C1）在外周区域（区域0）高度富集，中心区域（区域1）以TM4SF1+癌细胞（Epi-C0）为主。
通过分析IAC样品（TD1，TD2）发现癌症区域可以分为两个具有清晰边界的癌症亚区0和5。癌症区域0和5均高度富集TM4SF1+癌细胞 （Epi-C0） 和 UBE2C+癌细胞（Epi-C6），尤其是区域5，这与scRNA-seq的结果一致，即TM4SF1+（Epi-C0）和UBE2C+（Epi-C6）癌细胞的比例在IAC中均显著升高。与癌症区域5相比，癌症区域 0 的 DNA 修复、MYC 靶标 v2 和氧化磷酸化途径高度激活。与区域0相比，TGF-β信号通路相关基因在癌症区域5中高表达。
GSVA显示几种致癌信号通路，包括Wnt/β-catenin信号转导、MYC靶点v2和血管生成通路，在外周区域（区域0）高度激活，而在中心区域（区域1）未观察到。癌细胞侵袭特性的获得更可能来自外周区域而不是中心区域。
与外周区域相比，TGF-β信号通路相关基因在中心区域高表达。鉴于发现TGF-β信号转导在癌症早期抑制细胞生长，与活性区域（外围区域）相比，AIS的中心区域似乎是惰性的。
与中心区域相比，增殖指数（如PCNA）在外周区域的表达程度一致。
monocle 3分析显示出从中心到边缘的分化趋势。
总之，随着LUAD从AIS向IAC的进展，癌细胞表现出越来越清晰的空间分布，肿瘤边缘的恶性特征更加突出，癌细胞的空间分布可能比癌细胞的类型更重要。AIS到MIA的过程是LUAD侵袭的关键步骤，UBE2C+癌细胞亚群被发现在驱动这一过程中起着至关重要的作用。LUAD的多组学空间定位证明，癌细胞与TME之间的TGF-β信号相互作用以及调节免疫逃逸的空间变化与LUAD侵袭有关。
总结
在单细胞水平上鉴定了四个癌细胞亚群。UBE2C+癌细胞亚群参与LUAD侵袭过程的早期和晚期，表明UBE2C可能是LUAD侵袭的始因。
首次绘制了LUAD的空间异质性图，通过超几何分布分析整合了细胞类型特异性的scRNA-seq数据和位置特异性ST数据，UBE2C+癌细胞主要分布在IAC和外周癌区，代表了更活跃的肿瘤生物学行为。
从ST结果来看，在AIS中，癌症区域没有Treg浸润，而在IAC中，癌细胞将Tregs募集到癌症区域，这表明Tregs在癌症区域的积累启动了LUAD的早期侵袭过程。在IAC中发现了癌细胞和TME之间TGF-β信号传导的强相互作用诱导激活，这在AIS和MIA中未观察到，这与TGF-β信号转导在癌症转移晚期的关键作用一致。
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