AD星形胶质细胞与小胶质细胞的snRNA-seq数据分析

AD星形胶质细胞与小胶质细胞的snRNA-seq数据分析 by 生信技能树

《单细胞天地》公众号解读的部分文章其实在咱们学徒培养的数据分析图表复现环节有讨论过，而且有录屏，不知道为什么看的人很少，可能是“酒香也怕巷子深”吧！

如果你看完了下面的解读，仍然感兴趣可以看我们的b站关于它的在线讨论：https://space.bilibili.com/338686099/video

下面是单细胞天地公众号

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文章信息

题目：Diverse human astrocyte and microglial transcriptional responses to Alzheimer’s pathology
期刊：Acta Neuropathologica (2022) 143:75–91
日期：2021年11月
DOI：https://doi.org/10.1007/s00401-021-02372-6

1、测序样本

24个样本：AD与NDC的EC(entorhinal)与SSC(somatosensory) cortical region(2×2×6)
使用Immunohistochemistry量化每个样本的p-Tau与Amyloid-beta指标

本文是想研究astrocyte星形胶质细胞与microglial小胶质细胞在AD中所发挥的作用。但是The proportions of microglia and astrocytes defined by snR-NASeq of nuclei isolated from the human brain post-mortem are low and variable。
因此本文采取的方式是使用阴性选择方法去除样本中的neuron与oligodendroglia，间接富集Astro与Micro，再进行snRNA-seq测序。测序数据已经上传到GSE160936。

2、鉴定细胞类型

经数据预处理后，使用AUCell，结合细胞marker基因进行细胞类型注释，如下图所示Astro(52706)与Micro(27592)占大部分

文章为了验证所富集的Astro与Micro不存在偏差bias，做了进一步的分析。即对上述24个样本又做了非富集的snRNAseq测序，注释出细胞类型。通过比较同一样本的富集与非富集的Astro(Micro)细胞类型的Top10% HVG高变基因的相关性，从而表示富集到Astro(Micro)不存在bias。

24+24=48个snRNAseq，这篇文章应该花了很多钱。

3、差异基因分析

文章并非按一般的AD/NAD差异分析，而是将基因表达与样本的p-Tau(或Amyloid-beta)指标进行回归分析，并校正性别、线粒体含量等因素。
此时基因差异表达倍数的含义表示为pTau (or amyloid density)发生一单位的变化，基因表达差异的log2倍数（斜率）。如下例图所示

文章提到是使用MAST包的zlm()进行的回归分析。

按照上述思路可分别对Astro与Micro进行Amyloid-beta、pTau两个指标的回归分析，即得到4类差异基因。如下图所示在Astro中的两类差异基因火山图。从右侧的韦恩图可以得到有208个基因表达与Amyloid-beta、pTau正相关等信息。

继续以Astro差异基因为例。文章将Amyloid-beta、pTau两个指标的回归差异基因进行通路富集分析(GO/Reactome/Wikipathways)，得出结论：Increased expression of genes related to metal ion homeostasis, proteostasis, and inflammation in astrocytes with AD pathology。同法，也对Micro差异基因结果进行类似的分析。

4、细胞通讯分析

使用CellChat包对Astro与Micro进行ligand–receptor的细胞间通讯分析。
根据配受体基因与Amyloid-beta、pTau两个指标的相关性，将CellChat结果分为3类：
（1）Amyloid-beta and pTau；
（2）Amyloid-beta only；
（3）pTau only
如下图是Amyloid-beta and pTau的结果，可结合配受体对的功能展开分析与讨论。

5、共表达网络分析

文章使用MEGENA进行共表达网络分析，计算得到astrocytes与microglia分别在EC与SSC的module；使用SCENIC进行转录因子分析，也分别得到astrocytes与microglia分别在EC与SSC的regulons。
然后使用AUCell包计算出每个细胞核的对应细胞类型模块的score。然后结合Aβ/pTau指标进行类似上述差异基因的回归分析。即Aβ/pTau指标变化与模块表达score是否存在相关性。根据分析结果，初步得到结论：The EC and SSC show similar co‑expression signatures。如下图展示部分module与regulon

根据上述得到的基因模块表达特征与功能特征，分析AD GWAS基因所发挥的cell-specific功能。例如下图所示：GPNMB已知是AD的biomarker，它是Micro的amyloid-beta and pTau 正相关模块(module11)的hub gene；而且该基因在AD的Micro中也是相对高表达。

6、亚群特征分析

根据之前的细胞类型注释，将Astro与Micro进行在亚群分析。

在亚群分析时，主要结合细胞亚群的marker基因功能，是否为上述的差异基因；亚群熷细胞是否特异表达/参与上述计算得到的module/regulon等，具体可参看原文献。

个人想法

这篇单细胞文章测序样本量大，且有创新之处，即富集的Astro与Micro。而且计算差异基因方式很有新意，即进行病理指标的回归，也许更可以反映出基因表达水平与AD病理特征的关系。文章也使用多种多样的单细胞数据分析手段，例如亚群分析、细胞通讯分析、转录因子分析。总之无论是测序数据还是分析方法，都挺有借鉴价值的。