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在PD-1阻断下的人类结直肠癌的全面跨组织单细胞景观
局部协调的细胞程序展现出与反应相关联的动力学特性
较高的基线Ttr样细胞浸润与更好的治疗反应相关
增加与血液相关的Ttr样细胞水平有利于提高治疗效果
PD-1阻断后人CRC的动态单细胞跨组织景观
图1. 新辅助抗PD-1治疗期间CRC患者的动态单细胞景观 (A) 对接受新辅助抗PD-1治疗的22名患者进行动态追踪。 (B) 入组患者的临床特征。 (C) 样本的代表性磁共振成像(MRI)图像。红色圆圈标记肿瘤区域。 (D) 实验设计概览(顶部)和分析方法(底部)。 (E) 统一流形近似与投影(UMAP)图显示了精细的细胞簇。每个细胞的主要组分身份显示在左侧的插图中。 (F) 盒形图显示了基线比例(左)和时间动态(右)的肿瘤组织中的T细胞数量。每个点代表一名患者。采用双侧t检验(两组间)和ANOVA(三组间)。所有主要免疫细胞类型的错误发现率(FDR)进行了调整。更多信息见补充图S1和S2;补充表S1、S2和S3。
肿瘤生态系统中的协调细胞程序
图2. 展示了与响应性具有不同关联的协调性肿瘤微环境细胞程序。(A)散点图显示了每种细胞类型的时间和组织富集情况。每个点代表一种细胞类型,颜色如图1E所示。F检验。时间指数(Ti)是通过拟合治疗后肿瘤退缩率与细胞动力学之间的线性模型计算得出的,其中r²量化了这种关联。(B)肿瘤微环境中的非负矩阵分解(NMF)基细胞程序。x轴代表肿瘤微环境中的细胞类型,y轴表示每种细胞类型在每个程序中的载荷量。(C)箱形图显示了三种选定细胞程序在肿瘤中的活动动力学。中间线表示中位数,下铰链和上铰链分别代表第25百分位和第75百分位,须状线表示四分位距的1.5倍。每个点代表一个患者。双侧t检验(两组间)和方差分析(三组间)。所有NMF程序中的相同成对比较进行了FDR调整。(D)雷达图显示了每个响应性患者在不同治疗阶段选定程序的活动情况。从圆心到点的距离代表了按比例缩放的程序活动(范围从0到1)。(E)代表性多重免疫荧光染色显示次级淋巴结构(TLS)。在主视图和放大视图中,标尺分别对应500 μm和100 μm。(F)折线图显示了肿瘤样本中次级淋巴结构的面积(左)和数量(右)。每个点代表一个肿瘤样本。线条表示配对样本。双侧t检验。另见图S3;表S1、S3和S4
肿瘤中耗竭的CD8+ T细胞的响应关联
图3. 疲劳T细胞与治疗效果的相关性 (A) UMAP图显示组织富集的CD8+ T细胞亚型,排除了血液富集的亚型(血液中的Ro/e > 1)。 (B) UMAP图显示跨治疗阶段和反应组别的组织CD8+ T细胞密度。 (C和D) 散点图显示肿瘤退缩比率与基线相关性,展示了肿瘤组织中Tex频率 (C) 和基线克隆扩增水平 (D)。每个点代表一位患者。F检验。 (E和F) PD-1阻断后,由细胞丰度 (E) 和克隆扩增水平 (F) 表征的肿瘤内c23_CD8_Tex_LAYN的动力学变化。每个点代表一位患者。双侧t检验。 (G和H) 在NSCLC患者中,由细胞丰度 (G) 和克隆扩增水平 (H) 表征的终末期Tex的动力学变化。'高'和'低'分类源自原始NSCLC研究。中心线表示中位值,下铰链和上铰链分别代表第25和第75百分位数,须部分表示1.5倍四分位距。每个点代表一位患者。双侧t检验。参见补充图S4。
PD-1阻断期间肿瘤反应性CD8+ T细胞的不同动态反映了治疗效果
图4. 在PD-1阻断下的肿瘤反应样CD8+ T细胞 (A) 肿瘤活检样本中CD3+ CD8+ CXCL13+细胞的代表性多重免疫荧光染色。箭头表示CD3+ CD8+ CXCL13+细胞。虚线框指示放大的视图。主视图和放大的视图中的标尺分别对应200 μm和20 μm。 (B) 盒形图显示CXCL13+ CD3+ CD8+细胞占CD3+细胞的比例。中心线表示中位值,下铰链和上铰链分别代表第25百分位和第75百分位,须状线表示1.5倍的四分位距。每个点代表一个肿瘤样本。双侧t检验。 (C) 折线图显示(B)中七个患者在接受治疗匹配样本时CXCL13+ CD3+ CD8+细胞比例的变化。每个点代表一个肿瘤样本。 (D) UMAP图显示所有组织类型中的Ttr样亚型(左侧)以及代表性基因的表达(右侧)。 (E) UMAP图显示不同治疗阶段Ttr样亚型的分布。 (F) 盒形图显示Texp和Text细胞占全部Ttr样细胞(顶部)及肿瘤内T细胞(底部)的比例。中心线表示中位值,下铰链和上铰链分别代表第25百分位和第75百分位,须状线表示1.5倍的四分位距。每个点代表一个患者。双侧t检验(对于所有Ttr样细胞亚群在肿瘤中的相同配对比较进行了FDR调整)及ANOVA检验(对于三个组别中的所有Ttr样细胞亚群在肿瘤中进行了FDR调整)。 (G) 饼状图显示代表性克隆(考虑所有组织类型)在不同治疗阶段的Ttr样亚型组成。参见补充图S5和S6;补充表S1。
在有效治疗干预下肿瘤反应性样CD8+ T细胞的周围关联
图5. 在PD-1阻断下的肿瘤反应样CD8+ T细胞的周围关联 (A) UMAP图显示Ttr样细胞的解剖部位(左)和血液关联(右)。 (B) 直方图显示治疗后血液相关Ttr样克隆最早可检测到的阶段。仅显示了具有可检测治疗后血液相关Ttr样细胞的完全缓解和部分缓解患者。 (C) 热图显示代表性标志基因在Ttr样亚群和循环非Ttr样细胞中的表达情况。 (D) UMAP图显示PD-1阻断后Ttr样亚群的动力学变化。 (E) 箱线图显示不同治疗阶段肿瘤中血液相关Ttr样细胞的比例。中心线表示中位值,下铰链和上铰链分别代表第25和第75百分位数,而须状线表示1.5倍的四分位距。单侧t检验。另见补充图S7。
外周T细胞特征表明对PD-1阻断有反应
图6. 与CRC治疗反应相关的外周特征 (A) 盒图显示循环CD8+ T细胞的克隆多样性。中心线表示中位值,下铰链和上铰链分别代表第25百分位和第75百分位,须状线表示四分位距的1.5倍范围。每个点代表一个患者。双侧t检验。 (B) 肿瘤退缩与循环CD8+ T细胞中扩增或新出现的克隆计数之间的相关性。每个点代表一个患者。F检验。 (C) UMAP图显示循环CD8+ T细胞的亚型(左)和肿瘤反应性(右)。 (D) 密度图显示循环CD8+ T细胞克隆的克隆大小分布。 (E) 火山图显示循环CD8+ T细胞中Ttr样细胞与非Ttr样细胞之间差异表达的基因。红色点表示调整后的p值小于0.05的单个基因,双侧t检验。 (F) 基线时循环Ttr样和非Ttr样CD8+ T细胞中富集的途径。NES,标准化富集得分。 (G) 在我们的CRC队列(左)和一个外部HNSCC数据集(右)中预测评分的受试者工作特征(ROC)曲线。 (H) 盒图显示我们CRC队列(左)和一个外部HNSCC数据集(右)中的基线预测评分。双侧t检验。对于HNSCC数据集,比较是在病理反应高(N=7)和中位(N=10)的患者间进行。 (I) 盒图显示PD-1阻断后预测评分的变化。双侧t检验。 (J) 代表性直方图显示外周CD3+ CD8+ 细胞HLA-DR的荧光强度。 (K) 盒图显示外周CD3+ CD8+ 细胞HLA-DR的平均蛋白表达水平。每个点代表一个样本。双侧t检验。另见图S7;表S1、S3和S5。
图7. 在PD-1阻断下的CRC局部和全身免疫模型(A-D)在PD-1阻断下的CRC局部和全身免疫模型。 在局部TME中,协调的细胞程序(由虚线标记)显示了不同基线活性和不同反应组PD-1阻断后的治疗诱导变化(A)。 在克隆水平上,Ttr样亚型在肿瘤中显示出不同的基线富集和动态模式,以及在CR和PR组治疗后不同的血液相关性(B)。 Ttr样细胞从血液浸润到肿瘤组织伴随表型变化(C)。 循环CD8+ T细胞能够在基线时区分CR和PR组(D)。
限制条件
关键资源表格
资源可用性
主要联系人
材料可用性
数据和代码的可获得性
实验模型和研究参与者详情
人类样本
小鼠模型
方法详情
样本采集与处理
单细胞分选及数据生成
多重免疫荧光测定
单细胞RNA测序数据处理
降维和无监督聚类
scTCR-seq数据处理
比例分析
差异表达分析
组织富集分析
用于细胞程序识别的NMF分析
细胞相互作用分析
识别肿瘤反应性类似的CD8+ T细胞
根据肿瘤组织中Tex (c23)细胞的TCR序列,提取潜在的Tex谱系克隆。
排除大小小于等于3或CXCL13平均表达水平低于0.1的克隆。
从(2)中检索出在整个肿瘤、相邻正常组织和外周血中剩余的高质量克隆型的所有细胞。
肿瘤反应样CD8 T细胞的表型映射
CD8+ T细胞特征分数的定义
预测得分识别
对于每位患者,基线循环CD8+ T细胞中每个MHC II相关基因的表达被平均化,从而得到一个患者×基因的输入表达矩阵。
随后,基于交叉验证中最佳的准确性表现选择了最优调参的λ。对于选定的λ,每个变量(基因)都被赋予了一个系数。
那些具有正系数的基因(HLA-DRA、HLA-DQA1、HLA-DQB1 和 CD74)被提取作为最优变量。
我们将细胞级别的预测器定义为通过Seurat函数AddModuleScore使用默认参数获得的HLA-DRA、HLA-DQA1、HLA-DQB1和CD74的特征分数。值得注意的是,我们并没有直接使用回归模型来进行预测,考虑到这些学习到的系数可能在这个CRC数据集上过度拟合了。
最后,对于每位患者,我们将所有循环中的 CD8+ T 细胞获得的模块评分进行平均,作为患者层面的预测指标。
量化与统计分析
统计分析
附加资源
https://mp.weixin.qq.com/s/F81LzNgrk4hFpEXDm_1E-A