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4 weeks ago 文献阅读：发育中皮层细胞类型和功能的视觉依赖性规范 by TigerZ 生信宝库
文献介绍
文献题目： 发育中皮层细胞类型和功能的视觉依赖性规范
研究团队： S. Lawrence Zipursky（美国加利福尼亚大学洛杉矶分校）、Karthik Shekhar（美国加利福尼亚大学洛杉矶分校）
发表时间： 2022-01-20
发表期刊： Cell
影响因子： 66.8（2022年）
DOI： 10.1016/j.cell.2021.12.022
摘要
出生后（postnatal）的经历在塑造皮质环路中的作用，虽然长期以来受到人们的重视，但在细胞类型层面却知之甚少。作者利用 snRNAseq、视觉剥夺、遗传学和功能成像在小鼠初级视觉皮层（V1）中探索了这一点。作者发现视觉选择性地驱动上层（L2/3/4）glutamatergic 细胞类型的规范，而更深层的 glutamatergic、GABAergic、non-neuronal 细胞类型在睁眼之前就已建立。L2/3 细胞类型形成一个经历依赖的空间连续体，由 ~200 个基因的分级表达定义，包括细胞粘附和突触形成的调节因子。其中一个基因 Igsf9b 是一种编码抑制性突触细胞粘附分子的视觉依赖性基因，是 L2/3 双眼反应正常发育所必需的。总之，视觉通过调节细胞类型特异性基因表达程序优先调节上层 glutamatergic 细胞类型的发育。
前言
哺乳动物皮质中神经环路的建立依赖于发育中的出生后动物与其环境的相互作用。皮质环路由通过复杂突触网络互连的不同细胞类型组成。该环路的形成依赖于细胞识别分子和感觉独立神经活动介导的遗传 hard-wired 机制。在出生后发育过程中，该环路的成熟需要依赖于经历的过程。这些发育可塑性时期被称为“关键时期（critical periods）”，在感觉皮层区域观察到，并调节语言发展和认知等过程。
经历对初级视觉皮层 (V1) 皮层环路的影响可以通过小鼠的分子、遗传和功能分析来获得，因此非常适合机制研究。神经环路是由视觉形成的，并且这一过程可以通过对清醒行为动物的 V1 神经元进行纵向钙成像来研究。小鼠在出生后 14 天（P14）左右睁开眼睛。双眼环路在睁眼后对视觉敏感，但通过单眼剥夺对皮质眼优势的影响来证明和定义的敏感高峰期开始于睁眼后一周左右（~P21）并持续到 ~P35。这一时期的视觉经历对于双眼视觉神经环路的发育和维持是必要的。
单细胞转录组学的最新进展揭示了成年小鼠 V1 中巨大的神经元多样性。先前对关键时期视觉依赖性基因表达变化的研究依赖于比较正常饲养 (NR) 和视觉剥夺动物之间 V1 的 bulk 转录组图谱。因此，这些研究没有调查 V1 中不同细胞类型水平的视觉依赖性基因表达。这一分辨率对于理解经历在分子、细胞和功能水平上调节神经环路的机制至关重要。
在这里，作者通过结合 snRNAseq、统计推断、感觉扰动、遗传学和体内功能成像，研究了视觉在小鼠 V1 细胞类型及其环路发育中的作用。作者组装了出生后小鼠 V1 的发育转录组图谱。以此为基础，作者发现：（1）L2/3 glutamatergic 类型的建立和维持需要视觉，但 V1 中的其他细胞类型不需要视觉；(2) L2/3 glutamatergic 细胞类型在 V1 中组织为亚层，并通过～200 个基因的分级表达形成转录组连续体；(3) 在这些基因中，Igsf9b（一种视觉调节细胞粘附分子）是 L2/3 glutamatergic 神经元功能成熟所必需的。总之，作者的研究为未来研究经历如何调节大脑细胞类型规范建立了一个框架。
研究结果
1. 使用 snRNA-seq 对小鼠 V1 发育进行转录分析
为了调查 V1 细胞的转录组多样性和成熟度，作者使用基于液滴的 snRNA-seq 来分析正常饲养（NR）小鼠出生后发育过程中的该区域（Figures 1A and S1D）。作者从六个出生后时间点收集了样本：P8、P14、P17、P21、P28 和 P38（Figure 1B）。其中三个是在眼睛优势可塑性的经典关键期之前，突触发生发生在 P8 和眼睛张开 (P14) 之间（Figures S1A-S1C），并且其余三个跨越了眼部优势可塑性的关键时期，包括其开始（P21）、峰值（P28）和结束（P38）。
(A) 小鼠视觉系统的示意图。Primary visual cortex (V1)，周围围绕着高级视觉区域：A, anterior; AL, anterolateral; AM, anteromedial; LI, laterointermediate; LM, lateromedial; P, posterior; PM, posteromedial; POR, postrhinal; RL, rostrolateral; TEA, temporal anterior areas。
(B) V1 snRNA-seq 谱实验流程，及 6 个出生后时期。
(C) V1 的细胞分型。
(D) 出生后发育过程中 V1 转录组多样性的 UMAP 可视化。中央面板显示了所有六个年龄的细胞，按亚类标识着色（Table S1）。外围面板显示来自不同年龄的细胞，根据通过聚类确定的类型标识进行着色。来自每个年龄和类的数据分别进行分析，然后合并以实现可视化目的。
每个时间点的数据由四个 snRNA-seq 文库重复组成，每个重复均源自从多只小鼠收集的细胞。对所得的基因表达矩阵进行过滤，以去除低质量的细胞和双细胞以及具有高比例线粒体转录物（> 1%）的细胞。总共，作者在六个时间点获得了 144,725 个高质量的核转录组（Figures S1D-S1H）。
2. V1 细胞类别、亚类和类型的出生后发育图谱
作者使用降维和聚类来推导出由细胞类、亚类和类型组成的发育分类法在六个时间点的每个时间点（Figures 1C, 1D, and S1D）。细胞类别包括谷氨酸能神经元（n = 92,856；3,176 genes/cell）、GABA 能神经元（n = 13,374；2,966 genes/cell）和非神经元细胞（n = 38,495；1,549 genes/cell），通过经典 markers 定义（Figure S1I; Table S1）。三种细胞类别的相对比例在生物重复中是一致的（数据未显示）。
谷氨酸能细胞在四个皮质层内分为八个亚类 - L2/3、L4、L5IT、L5NP、L5PT、L6CT、L6IT、L6b（Figure 2A and 2B）。作者还鉴定了六个 GABA 能亚类，其中包括由选择性表达 Pvalb、Sst、Vip、Lamp5 定义的四个众所周知的组以及选择性表达基因 Stac 和 Frem1 的两个较小的亚类。非神经元细胞包括少突胶质细胞、少突胶质细胞前体细胞、星形胶质细胞、血管和软脑膜细胞、内皮细胞和小胶质细胞（Figure 1D）。使用替代计算管道获得了类似的结果（Figure S1K）。作者发现，定义数据集中正在发育的子类的全转录组基因特征与最近对成年小鼠皮层的调查中确定的子类之间存在紧密的对应关系（Figure S1J）。
(A) V1 中谷氨酸能神经元在 L1-L6 层排列的神经元示意图。
(B) Tracks plot 显示谷氨酸能神经元中的亚类特异性标记基因。从每个亚类中随机选择 1000 个细胞进行绘图。
(C) 谷氨酸能亚类的细胞比例随着年龄的增长没有太大的变化。
(D) 在 P21 时期，对 V1 冠状面进行 FISH。Ccbe1 在 L2/3 谷氨酸能神经元中表达。Cux2 在 L2/3 和 L4 谷氨酸能神经元、抑制性神经元、非神经元细胞中表达。
(E) 转录组相似性确定了不同年龄的 V1 谷氨酸能神经元类型之间的时间关联。使用监督分类方法计算的桑基图。节点，每个年龄的单个 V1 谷氨酸能神经元类型（如 Figure 1D 所示）；边，根据转录组相似性着色。
(F) 调整后的兰德指数（ARI）值，根据转录组相似性，量化每对连续年龄之间谷氨酸能类型的时间对应关系。
(G) L2/3 和 L4 相比于 L5 和 L6，对聚类分辨率的变化更敏感。
大多数神经元亚类的相对比例随着时间的推移保持稳定（Figures 2C and S1L），尽管非神经元亚类的比例有所不同（Figure S1M）。这表明 V1 的神经元亚类组成是在最早的时间点 P8 之前建立的。作者还鉴定了亚类特异性标记（Figures 2B and S2A-S2E；Table S3）。其中包括 Ccbe1（含胶原蛋白和钙结合的表皮生长因子 [EGF] 结构域的蛋白 1），它对整个发育过程中的 L2/3 谷氨酸能神经元具有特异性（Figures 2D and S2A-S2C）。
接下来，作者分别对每个年龄段的每个类进行降维和聚类。之后，作者将转录组上不同的 clusters 称为 types。根据年龄，八个谷氨酸能亚类分为 14-16 种类型，六种 GABA 能亚类分为 14-15 种类型，六种非神经元亚类根据年龄分为 9-11 种类型（Figure 1D）。之后差异表达分析确定了每个年龄的稳健的细胞类型特异性 markers（Figures S3A–S3C; Table S4）。
3. 睁眼后确定 L2/3 和 4 神经元类型的转录组身份
虽然每个年龄阶段每个类中的细胞类型数量相似，但目前尚不清楚不同年龄下识别出的类型之间如何相互关联。使用转录组相似性作为时间关系的代理，作者使用监督分类框架跟踪每个类别内类型的出生后成熟度。作者观察到谷氨酸能神经元类型的成熟存在显着的亚类特异性差异（Figure 2E）。L5 和 L6 神经元类型（在较小程度上）在整个时间过程中紧密对应，表明这些类型是在睁眼之前建立并维持的。相反，上层神经元类型（L2/3 和 L4）表现出较差的对应性，表明逐渐规范。在 L2/3 内，P8 和 P14 的两种神经元类型在睁眼后成熟为三种类型。相比之下，GABA 能亚类和非神经元亚类的成熟模式差异不太明显（Figures S2F-S2I）。
这些谷氨酸能神经元类型发育时间的亚类特异性差异得到了五个定量观察的支持：(1) 不同年龄的 L5/6 类型可能以 1:1 的方式相互关联，而 L2/3/4 类型不是。这些差异基于调整后的兰德指数 (ARI)，这是两组 clusters 之间转录组对应性的衡量标准（Figure 2F）。此外，L2/3 和 L4 的聚类结果比 L5 和 L6 的聚类结果对分辨率参数的变化更敏感（p < 0.0001，单向方差分析）（Figure 2G）；(2) 在所有年龄段，L2/3 和 L4 类型之间的转录组分离低于 L5 和 L6 类型、GABA 能类型和非神经元类型之间的转录组分离 (Figures S2J-S2L)；(3) 区分 L2/3 和 L4 神经元类型的差异表达基因随年龄变化，而定义 L5 和 L6 神经元类型的差异表达基因则稳定（Figure S3D-S3G）；(4) 在识别每层中时间差异表达 (tDE) 基因的统计测试中，L2/3 和 4 包含的 tDE 基因数量是 L5 和 6 的两倍（Figure S3H）；(5) L2/3 和 L4 类型的相对频率随时间变化。相比之下，10 种 L5 和 L6 类型的相对比例（其中最小的总体频率为 1%）在整个时间过程中保持稳定。总之，这些结果表明，在 V1 的谷氨酸能神经元内，上层亚类（L2/3 和 L4）内类型的转录组规范发生得晚于下层亚类（L5 和 L6）内的转录组规范。
4. L2/3 神经元类型在空间上分离
作者从 P17 开始将 L2/3 谷氨酸能神经元分为三种类型（A、B、C），这是 P14 视力出现后评估的第一个时间点（Figure 3A）。这些在组织中使用原位杂交分别针对 L2/3_A、L2/3_B 和 L2/3_C 类型的标记基因 Cdh13、Trpc6 和 Chrm2 进行可视化（Figure 3B-3D）。在 L2/3 谷氨酸能神经元亚类中，这些转录本对上述谷氨酸能类型具有特异性。然而，它们也在其他子类中表达。表达三种转录本的细胞被组织成随着年龄的增长而变得更加明显的亚层：L2/3_A 靠近软脑膜，L2/3_C 与 L4 接壤，L2/3_B 位于其间（Figure 3D and 3E）。在这些亚层的边界处，细胞共表达超过一种类型特异性标记，表明缺乏离散、清晰的边界，并反映了在计算机中观察到的连续转录组排列（见下文）。
(A) V1 不同年龄段的 L2/3 谷氨酸能神经元类型的 UMAP 图。
(B) Dot plot 显示了按年龄排列的 L2/3 神经元类型中 L2/3 类型特异性基因的表达模式。
(C-D) P8 和 P38 时期 L2/3 的三个标记基因 Cdh13、Trpc6、Chrm2 的 FISH 图像。
(E) 6 个年龄段的 L2/3 细胞中 Cdh13、Trpc6、Chrm2 表达的伪彩色。
(F) 不同位置基因阳性的细胞数量。
(G-H) FISH 和 snRNA-seq 数据中定义的每个基因组中细胞的相对比例。
然而，在视力出现之前（P8 和 P14），仅解析了两种转录组类型。作者将它们表示为 AB 和 BC。AB 和 BC 根据 Cdh13 和 Chrm2 的差异表达被组织为两个亚层（Figures 3C and S4A-S4E），边界处的细胞共同表达这两个 markers。相反，在这些早期阶段，B marker Trpc6 在分散在 L2/3 中的细胞中表达较弱（Figures 3B, 3C, 3E–3H, S4D, and S4E）。P8 和 P38 之间 Cdh13 的分布存在显着差异。在 P8 时，Cdh13 延伸至 L2/3 的深层亚层，而到了 P38，表达仅限于 L2/3 顶部的狭窄细胞带。相比之下，Chrm2 表达稍微更多地延伸到 P38 的上亚层。多个 A、B 和 C 特异性 markers 在 P14 之前不表达，仅在后期出现（Figure S3D）。因此，作者推断 L2/3 谷氨酸能类型 A、B 和 C 源自视力出现后的 AB 和 BC 类型（Figure 2E）。
5. 视觉对于建立和维持 L2/3 神经元类型识别是必要的
睁眼后三种 L2/3 神经元类型的出现促使作者探索视觉在定义细胞类型中的作用。众所周知，在眼优势可塑性的关键时期（P21-P38），视觉对于皮质环路的发育是必需的。作者使用 snRNA-seq 来分析暗饲养 (dark reared, DR) 动物从 P21 到 P28 以及从 P21 到 P38 的 V1。为简洁起见，这些实验分别称为 P28DR 和 P38DR。作者还对从 P21 到 P28 DR 后暴露于 8 小时环境光的动物进行了分析，以评估长期剥夺后视觉刺激的影响（Figure 4A）。作者将此实验称为 P28DL（DL = dark light）。总的来说，作者在这三个实验中回收了 77,150 个高质量的细胞核，并使用应用于 NR 样本的相同计算管道识别了类别、子类和类型（Figure 4B）。
(A) 实验示意图。三种饲养条件的数据：从 P21-P28 黑暗饲养（P28DR）、从 P21-P38 黑暗饲养（P38DR），从 P21-P28 黑暗饲养+8h光照（P28DL）。
(B) P28DR、P38DR、P28DL 的 V1 snRNAseq UMAP。
(C) P28DR、P38DR、P28DL 三个实验组与对应时期的正常饲养组之间，每一层的调整后的兰德指数（ARI）。发现 dark reared (DR) 破坏了谷氨酸能神经元的 L2/3 和 L4 的类型身份，但没有破坏 L5 和 L6 的类型身份。
(D-E) 在正常饲养 (NR) 小鼠中发现的细胞类型标记物在 L2/3 中被 dark reared (DR) 破坏，在 L4 中被轻微破坏，但在 L5 和 L6 中没有被破坏。
(F) 与正常饲养 (NR) 小鼠相比，dark reared (DR) 小鼠中表达 Trpc6 的细胞数量急剧下降，表达 Cdh13 的细胞数量有所增加，表达区域延伸到更深的层。
(G-H) 在 P38 时，dark reared (DR) 小鼠的两层模式比在 P28 时更为显著。因此，在 dark reared (DR) 的情况下，这些标记物的表达模式与视觉开始前的表达模式相似。失去的细胞类型是部分可逆的，在 P21 和 P28 之间 dark reared (DR) 后暴露于环境光 8 小时 (DL) 的小鼠 L2/3 转录组类群的基因表达模式显著恢复。这些结果表明，维持 L2/3 细胞类型的转录组和空间特性需要视觉。
(I-J) FISH 和 snRNA-seq 数据中定义的每个基因组中 L2/3 细胞的相对比例。
作者进行了三项计算分析，以探讨视觉剥夺（DR 和 DL）对 NR 小鼠中观察到的转录组模式的影响。首先，作者比较了三种条件下细胞类型的总体转录谱。作者发现 DR 破坏了 L2/3 和 L4 的类型识别，但没有破坏 L5 和 L6 谷氨酸能神经元（Figures 4C and S5F）。此外，DR 既不改变定义亚类的基因表达模式，也不改变定义 GABA 能和非神经元细胞类型的基因表达模式（Figures S5A-S5C）。其次，在 NR 小鼠中鉴定的细胞类型标记在 L2/3 中被 DR 破坏，在 L4 中被轻微破坏，但在 L5 和 6 中没有被 DR 破坏（Figures 4D, 4E, S5D, and S5E）。第三，作者探讨了视觉剥夺对每一层内类型特异性基因的影响。虽然在比较 DR 和 NR 时，所有四层内的特征都不同，但 L2/3 的效果最为显着（Figure S6H）。因此，视觉选择性地影响上层谷氨酸能细胞类型的转录组谱。
DR 的效果在 L2/3 中尤其显着。在 DR 小鼠中观察到的 L2/3 clusters 与 NR 动物中的三种类型非常相似，并且细胞类型特异性标记基因的表达模式被破坏（Figures 4C and 4D）。与 NR 小鼠 L2/3 中 Cdh13、Trpc6 和 Chrm2 表达突出显示的三个亚层相比，在 DR 小鼠中仅观察到两个亚层。值得注意的是，表达 Trpc6 的细胞急剧减少（Figures 4F-4J），与 snRNA-seq 数据一致（Figure 4D）。表达 Cdh13 的细胞数量也有所增加，并且表达域扩展到更深的层。然而，这不仅仅是一种细胞类型的损失，而是整个 L2/3 基因表达模式的整体破坏（见下文，Figure 6）。两层模式在 DR 动物中在 P38 时比在 P28 时更为突出（Figures 4G–4I, S5H, and S5I）。因此，在没有视力的情况下，这些标记物的表达模式与视力出现之前的表达模式相似（参见 Figure 3E 中的 P8 和 P14 组）。
在关键期的前半段被剥夺光照的动物中细胞类型特性的丧失是部分可逆的。P21 和 P28 之间 DR 后暴露于 8 小时环境光的小鼠中的 L2/3 转录组类群显示出在 NR 动物中观察到的基因表达模式的显着恢复（Figures 4C, 4D, S5G, and S6H）。此外，这些动物中表达 Cdh13、Trpc6 和 Chrm2 的细胞的分层排列也向 NR 动物中观察到的方向转变（Figures 4F-4J、S5H and S5I）。这些结果表明，需要视觉来维持 L2/3 细胞类型的转录组和空间特性。
由于在没有视力和睁眼时细胞类型标记的空间表达相似，作者开始评估视力是否不仅是维持细胞类型所必需的，而且也是它们建立所必需的。为了测试这一点，作者对从 P8 到 P17 的 DR 小鼠进行了 DR（Figure 5A），并评估了组织切片中 Cdh13、Trpc6 和 Chrm2 的表达模式。这些小鼠在 L2/3 内有两个而不是三个亚层，类似于 P8 和 P14 NR 动物（Figures 5B-5D）。这些变化包括 Trpc6 表达细胞的急剧减少和 Cdh13 表达的增加，伴随着其表达域向没有视觉经验的小鼠的中间亚层扩展（Figure 5E）。这并不是对谷氨酸能细胞类型的普遍影响，因为 L5 神经元类型的相对比例对视觉体验的变化不敏感（Figure S4G and S4H）。总之，这些结果表明视觉选择性地作用于 L2/3 来建立和维持细胞类型。
(A) 实验示意图，为了评估视觉是否不仅是维持细胞类型所必需的，而且也是建立它们所必需的。
(B-D) 在 P17DR 小鼠中，Trpc6 表达显著减少，Cdh13 表达增加，其表达区域向中间亚层扩增。这并不是对谷氨酸能细胞类型的一般影响，因为 L5 神经元类型的相对比例对视觉体验的变化不敏感。总之，这些结果表明，视觉在 L2/3 中选择性地作用于建立和维持细胞类型。
6. L2/3 神经元类型和基因表达梯度的连续变化由视觉决定
L2/3 中对应于 A、B、C 类型的亚层部分重叠，反映了它们转录组的连续排列（Figure3A and 3E）。与这种连续排列相一致，NR 小鼠中 L2/3 类型的 285 个差异表达基因中超过 70% 表现出分级差异，而不是数字差异（Figures 6A and S6A-S6H）。在 DR 小鼠中，这些基因不再以 L2/3 clusters 之间的分级方式表达，尽管除了少数基因外，它们的总体（即大量）表达水平没有改变（Figure S6C）。通过在关键时期短暂恢复 DR 动物的正常视觉体验，这些梯度得到部分恢复（Figure 6A）。因此，视觉以亚层特异性方式选择性地调节基因表达，导致 L2/3 细胞类型的持续变化。
(A) 在正常饲养 (NR) 的小鼠中 L2/3_A、L2/3_B、L2/3_C 特异性基因的热图，以及这些特异性基因在 DR、DL 中的表达情况。视觉以一种亚层特异性的方式选择性地调控基因表达，有助于 L2/3 细胞类型的持续变化。
(B-C) 红色显示的胞表面分子（cell surface molecules, CSMs）基因，在 P21–P38 时期上调，在 DR 中下调，在 DL 中上调。
(D) MDGA1 和 IGSF9B 与 NLGN2 在突触上的相互作用示意图。MDGA1 可以阻止 NLGN2 在突触前与 NRXN 的相互作用。IGSF9B 和 NLGN2 一样，在突触后通过同源性结合，并在突触后与突触支架分子（SSCAM）相互作用。
(E-J) 由于 Igsf9b 的表达水平和动态是最稳健的，作者探讨了其在关键时期的功能。IGSF9B 是免疫球蛋白超家族的同种细胞粘附分子，可促进神经肽 2 (Nlgn2) 依赖性抑制性突触形成。Igsf9b 水平在睁眼前较低，并在关键时期以分级的方式增加。DR 在关键时期降低了 Igsf9b 的 L2/3 神经元中的表达，并轻微破坏了其分级表达。当 DR 动物暴露于环境光下 8 小时时（DL），这些作用被逆转，Igsf9b 的表达水平被上调。而 Mdga1，一个Nlgn2 的负调控因子，与 Igsf9b 呈相反的分级空间模式表达。
作者假设，以视觉依赖性方式暂时调节和表达的分级基因可能与关键时期 L2/3 的功能变化有关。有几个基因符合这种描述，包括细胞表面分子 (CSM) 和转录因子 (TF)（Figures 6B, 6C, S6I, and S6J）。其中包括先前显示参与神经环路发育的细胞表面和分泌蛋白，包括调节细胞识别（例如 Kirrel3、Sdk2）和突触粘附（例如 Tenm1 和 Cbln2）的蛋白（Figures 6B and 6C）。
为了从这组细胞中识别可能有助于关键期视觉依赖性环路变化的候选细胞表面蛋白，作者选择了在所有 L2/3 谷氨酸能类型中满足三个标准的基因：（1）在关键期选择性上调； (2) 在 DR 动物中下调；(3) 在 P28DL 动物中上调。五个基因（Igsf9b、Epha10、Cdh4、Sdk2 和 Sema4a）满足所有三个标准（Figure 6E and 6F），并且所有五个基因都编码与调节神经元布线有关的细胞表面蛋白，这增加了它们有助于经验依赖性环路发育的可能性在 L2/3 中。由于 Igsf9b 的表达水平和动态是该组中最稳定的，因此作者在关键时期探索了它的功能。
7. Igsf9b 敲除改变 L2/3 中的抑制性突触
IGSF9B 是免疫球蛋白超家族的同种细胞粘附分子，可促进神经肽 2 (Nlgn2) 依赖性抑制性突触形成（Figure 6D）。这种蛋白质特别令人感兴趣，因为抑制在关键时期调节 V1 环路中发挥着重要作用。作者使用荧光原位杂交 (FISH)（Figure 6G）评估了 L2/3 中 Igsf9b 转录本在发育不同时期的空间分布（Figure 6G），并通过将基因表达空间中 L2/3 神经元的转录组位置视为“pseudo”空间定位进行计算机模拟（Figure 6H）。Igsf9b 水平在睁眼前较低，并在关键时期以分级方式升高，有利于 L2/3 更深层次的表达增加。感觉活动进一步调节 Igsf9b 的表达水平和分层。关键时期的 DR 降低了 Igsf9b 的表达，并轻微扰乱了其在 L2/3 神经元中的分级表达（Figures 6F, 6I, 6J, and S6K）。当 DR 动物暴露于环境光 8 小时时，这些效应被逆转，并且 Igsf9b 表达水平上调。鉴于 Igsf9b 跨亚层的分级表达从上层到下层逐渐增加，特别有趣的是，编码另一种 Ig 超家族蛋白的第二个基因，Mdga1（Nlgn2 的负调节因子）（Figure 6D）以分级且与 Igsf9b 相反的空间表达模式（Figures 6G, 6H, and S6F）。睁眼后 Igsf9b 和 Mdga1 表达的时空动态共同形成沿 L2/3 软脑室轴的抑制性突触电位梯度，较低的亚层表现出增强的抑制作用。
为了探索 Igsf9b 在 L2/3 抑制性突触发育中的作用，作者检测了野生型 (WT) 和 Igsf9b 敲除 (KO) 小鼠中五种抑制性突触标记的表达。这些标记物包括三种突触后蛋白（γ-氨基丁酸 A 型受体亚基 α 1 [GABRA1]、neurolign2 [NLGN2] 和 gephryin [GPHN]）和两种突触前蛋白（突触前囊泡 GABA 转运蛋白 [VGAT] 和谷氨酸酶脱羧酶 [GAD65]）（Figure S7A）。相对于 WT 同窝小鼠，P37 KO 小鼠中突触后标记物 GABRA1 和 NGLN2 的表达水平显着降低（Figure S7B），但 GPHN 保持不变（未显示）。相比之下，突触前标记物 GAD65 和 VGAT 的水平有所增加（Figure S7B）；这种增加可能反映了对突触后标记物减少所反映的变化的稳态反应。与作者发现 L2/3 中 Igsf9b 的表达随深度增加而增加一致，这些表型在 L2/3 底部更加明显（Figures S7D-S7G、6G and 6H）。相比之下，KO 小鼠的兴奋性突触标记不受影响（Figure S7C）。因此，Igsf9b 的缺失会沿着 L2/3 软脑膜-心室轴以分级方式特异性影响抑制性突触。
8. Igsf9b 调节双眼环路的视觉依赖性成熟
V1 关键期的一个决定性特征是双眼神经元的视觉依赖性成熟，这是深度知觉（也称为立体视觉）所必需的。为了介导立体视觉，这些神经元必须选择性地响应来自双眼的相同类型的视觉信息（双眼匹配）。尽管睁眼后不久即可检测到双眼神经元，但它们在早期阶段表现出较差的匹配性。关键时期（P21-P36）的视觉体验改变了双眼细胞的数量；调节不佳的双眼细胞被渲染为单眼，而新的调节良好的双眼神经元是通过从另一只眼睛招募匹配的输入而从调节良好的单眼神经元产生的。
作者使用双眼 V1 体内双光子钙成像检查了 Igsf9b 是否是 L2/3 双眼反应正常发育所必需的（Figures S7H and S7I）。V1 的该区域不仅包括对双眼做出反应的神经元（即双眼细胞），而且还包括对仅呈现给同侧或对侧眼睛的刺激作出反应的单眼神经元。作者测量了 NR WT 和 Igsf9b KO 小鼠中数千个兴奋性神经元对每只眼睛在 P21 和 P36 刺激的反应（Figure 7A）。这些结果还与关键时期 NR 或 DR 的 GCaMP6s 转基因小鼠的结果进行了比较（Figure 7A）。在三个深度测量神经元反应，跨越 L2/3 的顶部（A 型）、中间（B 型）和底部（C 型）亚层，分别对应于低、中和高 Igsf9b 表达的区域（Figures 7B-7D and S7J–S7L）。在 P21 时，KO 小鼠的双眼神经元比例及其方向匹配与 WT 小鼠没有区别（Figure 7E）。这与 P21 之前 L2/3 中 Igsf9b 的低表达一致（Figure 6 and 7A）。在 P36，关键期结束后（此时 Igsf9b 表达通常会增加），在 KO 小鼠中仅观察到正常数量的大约一半的双眼神经元，并且这些少数神经元表现出较差的双眼匹配（Figure 7F）。这种表型类似于在 DR 小鼠中观察到的表型（Figure 7G）。
(A) 功能分析的实验设置。（上图）使用不同正弦光栅以 4 Hz 顺序呈现的双光子 (2P) Ca2+ 成像示意图。视觉刺激分别呈现给每只眼睛。头部固定的老鼠在转轮上醒着。本研究中使用的小鼠是表达 AAV 编码的 jGCaMP7f 的 WT (Igsf9b+/+) 和 KO (Igsf9b−/−) 小鼠。(G)、(J) 和 (K) 包括作者未发表的 NR 和 DR（从 P22 到 P36 黑暗饲养）转基因小鼠的结果，这些小鼠携带在兴奋性神经元中表达的 GcaMP6。（下图）WT 和 KO 小鼠分别在 P21 和 P36（经典关键期的开始和结束）时成像。橙色，L2/3 中 Igsf9b mRNA 水平随时间的变化。
(B) 调整内核显示单个神经元对对侧眼睛的响应（见 Figure S7L）。颜色代表响应强度（颜色条，右侧）作为刺激方向（y 轴）和空间频率（对数刻度；x 轴）的函数。
(C) 单眼细胞对对侧 (C) 和同侧眼 (I) 的反应。每个神经元的内核都根据推断的尖峰峰值进行标准化。
(D) 如 (C) 所示，但针对匹配（顶部）和不匹配（底部）的双眼神经元。Δ 方向，两眼之间的方向偏好差异。
(E) （左图）P21 时 WT 和 KO 小鼠双眼神经元的比例。每个点都来自单个成像平面。平均值和标准差，黑点和线。Mann-Whitney U test。（右图） Δ P21 时 WT（4只小鼠，761个细胞）和 KO（3只小鼠，619个细胞）小鼠双眼神经元的方向。Mann-Whitney U test。请注意 P21 处双眼神经元不存在表型。
(F) 与 (E) 类似，但针对 P36 的双眼神经元。WT，5只小鼠，602个细胞； KO，5 只小鼠，269 个细胞。
(G) 与 (F) 类似，但针对 NR（4 只小鼠，339 个细胞）和 DR（3 只小鼠，78 个细胞）小鼠的双眼神经元。KO 和 DR 小鼠中的 P36 表型相似。WT (F) 和 NR (G) 之间比例的差异可能反映了遗传背景或实验设计的差异（即 GCaMP 的病毒表达与转基因表达或 GCaMP6s 和 jGCaMP7f 之间的差异）。
(H) 来自 WT 小鼠 P21 的调谐细胞示例。推断尖峰作为具有调谐响应的神经元的成像帧的函数。左上角的数字表示相对于刺激开始的成像帧。对于该神经元，信噪比 (SNR) 为 3.1，峰值响应发生在最佳刺激开始后 5 个成像帧或 323 毫秒，这与 jGCaMP7f 的动力学一致。
(I) 与 (H) 中类似，但针对同一小鼠中 P21 处未调谐的细胞。
(J) P21 和 P36 时 WT 和 KO 小鼠以及 P36 时 NR 和 DR 小鼠中调谐神经元的比例。每个点都来自单个成像平面。平均值和标准差，黑点和线。Mann-Whitney U test。
(K) （左图）WT（4 只小鼠，3,436 个神经元）或 KO（3 只小鼠，3,457 个神经元）小鼠中 P21 处所有成像神经元任一眼的 SNR 累积分布。垂直虚线标记视觉诱发反应的 SNR 阈值。图中显示了两个样本 Kolmogorov-Smirnov 检验的 p 值。（中图）与左侧相同，但针对 WT（5 只小鼠，2,698 个神经元）和 KO（5 只小鼠，2,699 个神经元）中 P36 的小鼠。（右图）与中间相同，但针对 NR（4 只小鼠，1905 个神经元）和 DR（3 只小鼠，1,188 个神经元）小鼠的神经元。分别测量每只眼睛的神经元反应。
(L) P36 WT 和 KO 小鼠 V1B L2/3 中调节神经元的比例随深度的变化。顶部、中间和底部表示覆盖每只小鼠 L2/3 内相应亚层的三个成像平面。每条灰线代表一只老鼠。平均值和平均值的标准误差显示为黑点和垂直线。带 Bonferroni 校正的 Mann-Whitney U 检验。
作者还注意到 KO 小鼠中调谐细胞的比例显着下降。未调谐的细胞是活跃的，但与调谐的细胞相比，它们不以时间锁定的方式对特定的视觉刺激做出反应（Figures 7H and 7I）。虽然视觉剥夺将视觉反应神经元的比例从 75% (NR) 降低至 66% (DR)，但 Igsf9b KO 将 P36 反应神经元的比例降低至 47%（Figure 7J）。KO 小鼠中调谐神经元比例从 P21 到 P36 的减少与关键期闭合时神经元反应的信噪比 (SNR) 显着降低相关（Figure 7K，左图和中图）。KO 小鼠的 SNR 受损程度比 DR 小鼠更严重（Figure 7K，比较中图和右图）。值得注意的是，KO 小鼠中调谐神经元减少的严重程度随着深度的增加而增加（Figure 7L），反映了 NR WT 小鼠中 L2/3 A、B 和 C 型中 Igsf9b 沿着软脑膜-心室轴的分级表达（见 Figure 6）。总而言之，这些发现证实 Igsf9b 沿 L2/3 软脑膜-心室轴以分级方式调节 L2/3 兴奋性神经元的视觉依赖性成熟。
讨论
关键时期定义了出生后发育的窗口，其中神经环路对经历特别敏感。在这里，作者试图深入了解在此期间经历如何在小鼠 V1 的细胞类型水平上影响环路。
出生后小鼠 V1 发育图谱
为了在细胞类型水平上研究视觉依赖性皮层发育，作者生成了小鼠 V1 的发育图谱，其中包含超过 220,000 个核转录组，跨越 6 个出生后年龄和 3 个光照饲养条件。该数据集的几个特征使作者能够识别稳健且可重复的生物信号。首先，作者在所有六个年龄段鉴定了相似数量的转录组类群，这些转录组类群是单独收集和处理的。对于所有类群，独立样本之间的转录组特性和相对比例具有可比性，与真正的细胞类型一致。其次，转录组成熟的计算推断表明，GABA能、深层谷氨酸能和非神经元细胞类型在睁眼之前就存在，并且在整个关键时期基本保持不变，无论动物是在正常的黑暗/光照循环中饲养还是在正常的黑暗/光照循环或黑暗中饲养。第三，这些稳定的细胞类型作为重要的“阴性对照”，使作者能够识别上层谷氨酸能神经元中的少数细胞类型，这些细胞类型在睁眼后被指定，并且其转录组特性受到视觉的深刻影响。第四，作者鉴定了细胞类型标记，使作者能够揭示 L2/3 细胞类型在亚层中的排列（Figure 3B-3D）。最后，发育图谱作为在细胞类型和分子分辨率下研究 V1 视觉依赖性功能成熟的基础。
L2/3 神经元类型的建立和维持需要视觉
在这项研究中，作者根据核心转录组特征定义了一种细胞类型，该特征将其与其他类型区分开来。当特征在发育过程中变得不变时，作者认为细胞类型被指定。对于 L2/3 和 4 细胞类型，这些特征是在睁眼后建立的，而对于其余细胞类型，它们从 P8 开始就存在。这些特征使作者能够评估感觉剥夺下细胞类型特异性的基因调控。虽然活性依赖性基因表达变化发生在每一层，但变化在 L2/3 和 4 中更为广泛，其中细胞类型身份被破坏。对于更深的层（L5 和 L6），情况并非如此。
令人惊讶的是，L2/3 兴奋性神经元中转录组细胞类型身份的获得遵循与其功能成熟相似的时间过程。作者之前表明，睁眼时 L2/3 中的双眼神经元很少。在接下来的几天里，它们的数量会在一个依赖于视力的过程中增加。在关键时期，这些双眼神经元（其中大部分没有调节）会变成单眼神经元。与此同时，新的双眼神经元是由其他经过良好调整的单眼神经元的转换形成的，这些神经元获得了与另一只眼睛相匹配的反应。正是通过这种神经元的交换，经过良好调整和匹配的双眼神经元出现，从而产生成熟的双眼环路。这个过程依赖于关键时期的视觉。活动可能会驱动细胞类型的变化，进而指示环路组织的变化，或者，转录组程序可以通过环路活动进行调节。需要进一步的实验来区分这些机制和其他机制。上层皮质细胞类型的经验依赖性调节可能是关键时期皮质发育的一般原则。
L2/3 身份和亚层排列的连续变化
尽管无监督聚类定义了 L2/3 中三种主要的谷氨酸能神经元类型，但它们之间的基因表达差异是分级的，导致转录组身份的连续变化（Figures 6A, S6A, and S6B）。这种连续的变化在计算上被视为空间分级，通过 FISH 在 L2/3 中进行亚层排列。这不是谷氨酸能细胞类型规范的一般特征，例如，L5 中的谷氨酸能细胞类型身份既不分级也不依赖于视觉。据报道，哺乳动物大脑其他区域的细胞类型身份不断变化。
L2/3 的分子异质性反映了功能差异，这一点得到了最近对成人 V1 的逆行标记分析的支持，该分析识别了投射到前外侧 (AL) 和后内侧 (PM) 较高视觉区域（HVA）的 L2/3 谷氨酸能神经元的转录特征。PM 和 AL 投射神经元位于 L2/3 的上部和下部区域，并分别表达标记物 Cntn5/Grm1 和 Astn2/Kcnh5（Figure S6D）。在作者的数据中，这些标记物沿着软脑室轴以分级和相反的方式表达，表明 PM 和 AL 投射的 L2/3 神经元分别定位于上（A 型）和下（C 型）亚层（Figure S6E）。
L2/3 神经元形成许多处理不同视觉信息的“局部”环路，但这些环路尚未在细胞类型水平上定义。虽然给定的兴奋性神经元可能参与多个环路，但有证据表明突触特异性。人们很容易推测这种功能分离可能部分是由于我们的转录组分析中发现的神经元之间的分级分子差异所致。这些分级差异也可能沿着中外侧和前后轴存在，以进一步将 V1 细分为功能环路。
L2/3 中经历依赖性细胞类型规范
作者的主要发现之一是视觉指定了 V1 中的 L2/3 细胞类型，并且这些细胞类型以亚层方式排列。最近的研究报告了除了视觉皮层之外，小鼠运动皮层 L2/3 中细胞类型的亚层组织，表明该区域的模式可能涉及类似的经历依赖机制。人类皮质 L2/3 亚层中排列的相似细胞类型连续体的新兴转录组学、形态学和生理学证据提出了令人兴奋的可能性，即依赖于经历的细胞类型规范可能是哺乳动物的一般原则皮质发育。
Igsf9b 是一种依赖于视觉的皮质环路调节器
依赖于经历的活动模式可能会促进调节线路的识别分子的表达。事实上，不同的经历独立活动模式已被证明可以调节小鼠嗅觉系统中细胞类型特异性布线基因的表达。作者对 L2/3 神经元中表达的视觉调节识别分子的鉴定以及对 Igsf9b 的遗传研究为以下观点提供了支持：经历依赖性过程也可能有助于细胞类型特异性布线（Figure 7 and S7）。
对缺乏 Igsf9b 的小鼠 V1 的分析揭示了抑制性突触标记物的变化，但兴奋性突触标记物没有变化。更显着的是，Igsf9b−/− 小鼠的双眼神经元比例和调谐神经元比例显着下降。对于后一种表型，缺陷的严重程度在更深的亚层中增加，其中在 WT 动物中，Igsf9b 表达更高。在光遗传学实验中观察到对谷氨酸能神经元的调节（更广泛地在 L2/3 内）有类似的影响，在这些实验中，体周小清蛋白 (PV) 抑制性神经元活动受到抑制。因此，IGSF9B 可以在关键时期调节 L2/3 兴奋性神经元上的 PV 抑制输入。这些发现与之前证明 IGSF9B 在调节抑制性突触中的作用的研究一致。
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