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4 weeks ago 超燃思路来袭！浙江大学徐平龙/夏冰团队：“细胞衰老+cGAS-STING”双热点携手，干湿结合斩获一区11+！跟着大牛学起来！ by 生信滩
细胞衰老一直都是肿瘤微环境中经久不衰的话题，目前已经成为科学研究的热门关注点之一，中标率也在逐年上升，已成为国自然的“香饽饽”。专为大家提供独特而前沿的研究选题、分析思路和生信分析的大海哥怎会错过这个超级大热点呢，这不立马给大家安排相关的文献，一起来看看大牛们是如何利用热点发高分文章。ps：大海哥每天在线，给你提供最新的科研热点和分析方法，教你如何从idea到发文章！
今天大海哥要分享的是浙江大学徐平龙/夏冰团队于2024年2月发表在Science Advances杂志上，题为“IRF3 activates RB to authorize cGAS-STING-induced senescence and mitigate liver fibrosis”的一篇文章。本研究利用两种小鼠肝纤维化模型，结合免疫学、遗传学及药理学方法，发现cGAS-STING信号在诱导细胞衰老中发挥重要作用，并揭示其在限制肝纤维化方面意想不到的生物学作用。整篇文章不论是严密的思路还是创新的想法都是很值得学习的！PS:如何让研究课题精准命中，论文发表如探囊取物？这个问题让大海哥为你解答！无论是实验设计的巧妙布局，还是生信数据的深度挖掘，亦或是研究方案的瓶颈解决，大海哥都能为你提供贴心服务！
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题目：IRF3激活RB通过cGAS-STING诱导的衰老并减轻肝纤维化
杂志：Science Advances
影响因子：IF=11.7
发表时间：2024年2月
研究背景
细胞衰老是细胞生命历程的关键阶段之一，细胞的衰老死亡与新生细胞的生长之间的动态平衡是维持机体正常生命活动的基础。大量的研究报道已证明细胞衰老参与多种疾病的病理过程，研究并阐明细胞衰老的机制对治疗人类疾病具有重要意义。
cGAS-STING信号的破坏或过度激活会导致感染性疾病、自身免疫性疾病和自身炎症性疾病以及癌症。cGAS-STING驱动细胞衰老的发现是衰老研究的重大进展之一。然而，除已被报道的一种非规范的cGAS-STING-PKR样内质网激酶(PERK)途径在mRNA翻译水平上控制细胞衰老外，STING诱导衰老的潜在机制尚不清楚。因此，本研究旨在探讨cGAS-STING信号在诱导细胞衰老的作用机制。
研究思路
在本研究中，研究人员首先基于文献研究cGAS-STING关键信号成分在衰老过程中的作用，接着发现cGAS-STING-IRF3和p16INK4a-RB通路在DNA损伤引发的衰老中起着至关重要的作用，通过这一结果建立起两信号通路在调节细胞衰老中的联系并阐明IRF3驱动细胞衰老背后的分子机制。最后通过四氯化碳(CCl4)和胆管结扎(BDL)诱导的小鼠肝纤维化模型表明全身性IRF3基因敲除或在肝星状细胞中条件性敲除IRF3都能够加剧肝脏的纤维化水平。
研究结果
1.IRF3在启动细胞衰老中起关键作用。
cGAS-STING通路被认为是启动细胞衰老的关键触发因素，但其潜在机制尚不清楚。为探讨潜在机制，研究人员首先研究cGAS-STING关键信号成分cGAS、STING、TANK结合激酶1(TBK1)和IRF3在衰老过程中的作用。羟基脲(HU)是一种明确的cGAS-STING信号和细胞衰老的诱导剂，用羟基脲(HU)处理肠道上皮DLD1细胞，激活STING信号并导致TBK1和IRF3的磷酸化(图1A)。IRF3在长时间观测期间保持持续活跃(图1A)。IRF3基因敲除显著抑制DLD1细胞中DNA损伤诱导的衰老，而重新引入IRF3可以逆转这一效应(图1B和C)。上述结果表明，cGAS-STING-IRF3信号在诱导DNA损伤后的细胞衰老中起着显著作用。为进一步表征IRF3在HU诱导的衰老中的作用，研究人员进行mRNA测序转录组分析。HU处理后观察到大量基因表达变化(图1D)。基因集富集分析显示，IRF3 KO细胞中与细胞衰老标志物相关的基因显著减少(图1E)。HU处理后，WT细胞中编码SASP因子如CCL2、CXCL1和IL-8的mRNA的表达明显增强，而IRF3 KO DLD1细胞中无明显变化(图1F)。考虑到细胞衰老的不同触发因素，研究人员还研究IRF3缺失在不同细胞背景下的影响，包括用于评估复制性衰老的MRC-5人胚胎成纤维细胞(图1G)以及用于评估氧应激诱导的衰老的WT和IRF3鼠的自发永生化原代MEFs(图1H)。上述结果表明，IRF3在各种上游刺激诱导的衰老过程中发挥着关键作用。
图1 IRF3缺失可减少细胞衰老表型。
2.IRF3通过p16INK4a-RB途径调控细胞衰老。
已知IFN-α可激活下游Janus激酶信号转导器和转录信号激活因子，但未能逆转IRF3 KO细胞的衰老损伤(图2A和B)。考虑到IRF3 KO还降低促衰老的SASP因子如IL-6和IL-1α的表达。研究人员用衰老细胞(MS)或重组IL-6培养基处理IRF3 KO细胞。这种处理在一定程度上模拟IRF3诱导的衰老，但它未能有效地恢复IRF3 KO细胞的衰老表型(图2C和D)。上述观察结果表明，IRF3在衰老诱导过程中除在细胞因子产生中的作用外，还具有重要的调节功能。CDK4/6激酶是p16INK4a-RB通路中RB磷酸化的关键，其抑制可导致RB低磷酸化并引发衰老。值得注意的是，引入palbociclib(CDK4/6抑制剂)显著逆转IRF3 KO DLD1细胞中受抑制的衰老表型(图2E和F)。此外，RB的基因敲除几乎完全抑制HU诱导的衰老(图2G和H)。这说明强调p16INK4a-RB通路在DNA损伤引发的衰老中起着至关重要的作用。这些发现建立起cGAS-STING-IRF3和p16INK4a-RB信号通路在调节细胞衰老中的联系。
图2 IRF3通过p16INK4a-RB途径控制衰老
3.IRF3与细胞衰老的关键调控因子RB相关。
为阐明IRF3驱动细胞衰老背后的分子机制，研究人员构建稳定表达IRF3的DLD1，并使用质谱法鉴定潜在的IRF3相互作用蛋白。通过公共数据库数据发现衰老的中心调节因子RB是一个重要的IRF3标志物(图3A)。共免疫沉淀实验表明内源性IRF3和RB在DNA损伤诱导的衰老细胞中存在相互作用(图3B)。邻近结联实验(PLA)同样证实衰老细胞中内源性IRF3和RB蛋白存在关联(图3C)。与WT相比，IRF3的激活形式(IRF35D)与RB表现出强烈的相互作用(图3D)。此外，RB还与IRF7相互作用(图3D)。为确定RB和IRF3之间相互作用的特定结构域，研究人员使用一系列RB和IRF3截断突变体进行结构域映射分析发现IRF3的干扰素激活结构域(IAD)和RB的口袋B结构域(RB-B)对它们的相互作用至关重要(图3E-G)。通过检测IRF3突变体，研究人员发现IRF3 S221A突变(图3H)保留了诱导IFN基因的典型转录能力且丧失结合RB的能力(图3I)。相反，IRF3 R78A/R86A突变影响DNA结合域并抑制IFN信号激活，但仍然保留结合RB的能力(图3H-I)。这些发现表明，与RB的相互作用独立于IRF3的经典转录功能。
图3 IRF3直接与RB相互作用，RB是细胞衰老的关键调节因子。
4.IRF3减弱RB过度磷酸化并启动细胞衰老。
RB在细胞周期调控中起着关键作用，特别是它与E2F家族和其他转录因子的相互作用。RB在多个位点（如CDK4对T826和CDK6对T82）的磷酸化，是其抑制和E2Fs产生相互作用的关键。缺乏这些抑制性磷酸化的RB突变体(T821A/T826A，称为“活化RB”)对E2F蛋白具有高亲和力，显示出与拟磷酸化IRF3的强关联(图4A)。IRF3敲除可阻止应激诱导的人胚胎成纤维细胞MRC-5(图4B)和永生化MEFs(图4C)中T826磷酸化-RB的下调。将IRF3重新引入到IRF3 KO细胞中可恢复DNA损伤诱导的衰老过程中观察到的磷酸化-RB水平的降低(图4D)。此外，IRF3 S221A突变体的DLD1 IRF3 KO细胞抑制RB过度磷酸化的能力减弱(图4E)。这些数据表明IRF3对RB低磷酸化的强大调节以及IRF3在衰老中的重要性。相比之下，使用Tet-On系统诱导表达STING R281Q(STING的组成活性形式)，导致磷酸-RB水平逐渐降低(图4F)，细胞衰老增加(图4G)。为进一步探索这种调节，研究人员在A549细胞中使用STING敏感系统，如SA-β-Gal染色所示，A549细胞中的IRF3 KO抑制磷酸-RB的减少(图4H)并阻止衰老的诱导(图4I)。RB磷酸化通常促进细胞周期进程，而其去磷酸化通过关联和抑制E2F转录因子导致细胞增殖停滞。集落形成实验显示，诱导STING表达的A549细胞中存在明显的生长停滞(图4J)，细胞计数实验和EdU染色进一步证实这一点(图4K和图S4H)。值得注意的是，在STING-Flag Tet-On A549细胞中，与IRF3阴性KO细胞相比，IRF3的KO阻止这种增殖抑制(图4J-K)。这些数据表明，STING-TBK1-IRF3轴控制细胞进入衰老，导致增殖停滞。
图4 IRF3减弱RB的过度磷酸化。
5.IRF3- RB相互作用阻止CDK介导的RB磷酸化，从而激活RB。
为充分了解IRF3如何激活RB，研究人员生成表达各种形式IRF3的稳定DLD1细胞系，包括WT、S221A和R78A/R86A。IRF3 S221A预期不与RB相互作用(图5A-B)，这与减少进入衰老相关，SA-β-Gal染色(图5C)和SASP水平(图S5A)证明这一结果。然而，该突变体保留激活下游IFN信号的能力。这些观察结果强调IRF3-RB轴在对损伤的衰老调控中的重要性，而不依赖于IRF3的转录活性。此外，研究人员使用体外激酶测定系统，分别表达和纯化CDK4、CDK6、cyclin D1、RB和IRF35D蛋白。在这个系统中，CDK4/6在cyclin D1存在下，直接磷酸化RB的T826和T821位点，这一过程被CDK4/6抑制剂palbociclib抑制(图5D)。值得注意的是，IRF35D的加入以剂量依赖的方式阻断CDK4介导的RB磷酸化，这表明IRF3在阻止CDK4/6介导的RB失活中起着至关重要的作用，也是cGAS-STING-IRF3信号传导诱导细胞衰老的关键机制。为区分IRF35D是通过RB-IRF3相互作用影响CDK4/6激酶活性还是干扰CDK4/6-RB磷酸化，研究人员分析CDK4介导的另一种CDK4底物Smad3的磷酸化。CDK4介导的RB(而不是Smad3)磷酸化的选择性抑制(图5E)强调IRF3-RB相互作用的重要性。与缺乏RB相互作用能力的突变体不同，IRF35D破坏、RB-CDK4/6-cyclin D1相互作用(图5F)。这些结果提示IRF3通过与RB的相互作用阻止CDK介导的RB磷酸化的直接机制。接下来，研究人员评估IRF3在RB-E2F复合物形成中的作用。值得注意的是，IRF3的活化形式极大地促进RB和E2F1之间的关联(图5G)，在HU诱导的衰老细胞中观察到内源性E2F1和IRF3与RB的相互作用(图5H)，证实内源性RB-IRF3-E2F1复合物在DNA损伤响应中的存在。这些观察结果表明，cGAS-STING诱导的干扰素反应和衰老是相互联系和相互增强的，可能是因为细胞微环境中复杂的相互作用。研究结果阐明STING诱导的细胞衰老启动的直接分子机制，涉及在细胞核中形成IRF3-RB-E2F复合物抑制CDK介导的RB磷酸化并干扰E2F介导的转录。
图5 IRF3通过减弱CDK诱导的RB磷酸化而激活RB。
6.IRF3促进肝纤维化过程中HSC的衰老。
先前的研究强调细胞衰老在减轻肝纤维化中的关键作用。为研究STING-IRF3-RB轴在这种情况下的生理影响，研究人员研究四氯化碳(CCl4)或胆管结扎(BDL)诱导的小鼠肝纤维化。在CCl4或BDL治疗后，小鼠肝脏中明显存在衰老细胞和胶原纤维(图6A-B)，IRF3−/−肝脏的细胞衰老明显减少，这一表型与CDK4/6抑制剂Palbociclib相反(图66A-B)，表明IRF3在调节肝纤维化衰老中起关键作用。天狼星红染色证实，在CCl4诱导的肝纤维化模型中，IRF3-/-小鼠的胶原沉积面积更大，胶原mRNA水平更高(图6C-D)。在BDL诱导的模型中也观察到相同的结果(图6E)。疾病参数，包括血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平在BDL诱导的肝纤维化中升高，在IRF3−/−小鼠中进一步升高(图6F)。这些发现提示STING-IRF3-RB轴通过促进细胞衰老来抑制肝纤维化。为确定SA-β-Gal阳性的肝纤维化原代细胞类型，研究人员从CCl4治疗后的WT和IRF3-/-小鼠肝脏中分离出原代肝细胞(HCs)和NPCs。对衰老标记和SASP的分析表明，IRF3缺失主要影响NPCs的衰老，而不是HCs(图6G)。在CCl4诱导后，WT小鼠的原发性NPCs中发现IRF3磷酸化，在IRF3 KO NPCs中观察到磷酸化-RB水平升高(图6H)。NPCs的cGAS和STING mRNA和蛋白水平高于HCs(图6H-I)，这说明在肝纤维化过程中，NPCs的IRF3激活增强，衰老更明显。免疫荧光分析显示超过一半的HSC表达衰老标记p21Cip1/Waf1(图6J)。此外，IRF3−/−小鼠的HSC细胞衰老减少，Palbociclib治疗增加IRF3 KO小鼠的p21+HSC水平(图6J)，与SA-β-Gal染色结果相同(图6B)。这些观察结果支持IRF3-RB复合物在抑制HSC驱动的肝纤维化中的关键作用，并暗示CDK4/6抑制可能是纤维化性肝病的一种有希望的治疗方法。
图6 IRF3- RB轴调节肝纤维化过程中的衰老。
7.STING- IRF3- RB轴通过HSC衰老减少肝纤维化
为探索STING-IRF3-RB轴在肝纤维化过程中调节HSC细胞衰老中的体内作用，研究人员使用HSC特异性启动子驱动的腺相关病毒血清型-8(AAV8)-胶质纤维酸性蛋白(GFAP)(启动子)增强的绿色荧光蛋白(EGFP)-cre选择性地删除Irf3flox/flox小鼠HSC中的IRF3(图7A)。通过增加造血干细胞中Cre mRNA和EGFP的表达(图7B)以及分离的造血干细胞中IRF3蛋白水平的降低(图7C)证实靶向缺失。经CCl4处理后，在造血干细胞中观察到IRF3活化和RB低磷酸化(图7C)，靶向删除HSC中的IRF3导致衰老表型显著减少，这可以从持续的RB过度磷酸化(图7C)，衰老标记物如IL-6和p21Cip1/Waf1(图7D)以及衰老细胞减少(图7E)中看出。此外，在CCl4诱导的纤维化过程中，造血干细胞中IRF3的选择性缺失导致肝脏中胶原纤维聚集增加(图7F)和胶原相关基因表达升高(图7G)。在WT和条件IRF3 KO小鼠之间检测到胆管和血管附近的NPCs明显增加(图7H)，但肝脏中的炎症因子没有增加(图7I)。这些发现与IRF3 KO小鼠BDL模型的结果一致，强调cGAS-STING-IRF3-RB信号在HSC介导的肝纤维化中起关键抑制作用。
图7 在HSC中选择性删除IRF3可减缓HSC衰老并促进肝纤维化。
文章小结
本研究发现IRF3通过与RB互作形成IRF3-RB-E2F复合体，从而阻碍CDK4/6-cyclinD1-RB复合体的形成，因此保持RB在低磷酸化的活化状态以阻滞细胞周期，从而诱导细胞进入衰老状态。总的来说，这篇文章阐明cGAS-STING-IRF3-RB信号轴这一非经典的调控细胞衰老信号路径，并揭示其促进肝星状细胞衰老以减缓肝纤维化进展的生理和病理功能。这些新发现明确提出天然免疫机制调控器官纤维化的疾病和细胞类型依赖性，为肝纤维化的治疗提供了新的理论与实验依据。如果你想为你的研究增加深度和广度，如果你有idea却无实验思路，有数据却不知如何分析，都欢迎扫码找大海哥，让大海哥为你的科研之路保驾护航！
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