超易复现~整合 TCGA 和肝细胞癌单细胞测序数据建立预测预后和免疫治疗反应的分类器

超易复现~整合 TCGA 和肝细胞癌单细胞测序数据建立预测预后和免疫治疗反应的分类器 by 作图丫

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导语：主要的肝癌亚型是肝细胞癌 (HCC)。研究表明，HCC 中肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL) 的存在与更好的预后有关。然而，驱动肿瘤微环境 (TME) 中免疫细胞变异的分子途径仍然知之甚少。糖基化 (GLY) 相关基因在包括 HCC 在内的许多肿瘤的发病机制中起着至关重要的作用。

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背景介绍

今天小编为大家带来的这篇文章，研究旨在开发一种基于糖基化相关基因评分和肿瘤微环境评分的 GLY/TME 分类器，以提供一种新的预后模型来改善对临床结果的预测。文章发表在《metabolites》上，文章题目为：Integrating TCGA and Single-Cell Sequencing Data for Hepatocellular Carcinoma: A Novel Glycosylation (GLY)/ Tumor Microenvironment (TME) Classifier to Predict Prognosis and Immunotherapy Response。

研究设计

ntegrating TCGA and Single-Cell Sequencing Data for Hepatocellular Carcinoma: A Novel Glycosylation (GLY)/ Tumor Microenvironment (TME) Classifier to Predict Prognosis and Immunotherapy Response

本研究技术路线如图所示。

数据介绍

本研究所用数据集来自TCGA和GEO数据库。

结果解析

GLY评分和TME评分的构建

首先，基于MSigDB数据库，本研究通过搜索关键词“糖基化”并删除重复基因，收集了一个包含770个糖基化相关基因的基因集。利用“limma”包确定肿瘤和附近健康组织之间差异表达的糖基化相关基因。通常，在去除大多数样本中不表达的基因后，通过将筛选阈值设置为p值= 0.05，从770个糖基化相关基因中识别出603个差异表达的糖基化相关基因。然后，通过单变量Cox分析筛选出301个与预后相关的DEG，并使用热图显示这些糖基化相关基因在HCC与正常癌旁组织中的差异表达。

接下来，利用 LASSO 回归分析筛选出惩罚系数非零的糖基化相关基因，生成预后相关糖基化基因标记（图 1A），最后构建了稳健的预后基因标记，包括 PPIA、ALG3、CTSA、CAD、B3GAT3、TRAPPC3、HSP90AA1、SRD5A3、BAG2、DNAJC1、ADAMTS5、PLOD2、DYNC1LI1、ST6GALNAC4、CHP1 等 15 个基因，详细信息见附表 S4。森林图显示PPIA、ALG3、CTSA、CAD、B3GAT3、TRAPPC3、HSP90AA1、SRD5A3、BAG2、DNAJC1、ADAMTS5、PLOD2的风险比（HR）均大于1，提示这12个基因可能是风险预后因素。DYNC1LI1、ST6GALNAC4、CHP1的风险比小于1，可能是有利的预后因素（图1B）。棒棒糖图显示TCGA-LIHC队列中糖基化相关预后基因的基因表达倍数变化（logFC），其中正logFC表示HCC中基因表达与正常组织相比上调，而负logFC表示基因表达下调（图1C）。

图 1

接下来，本研究构建了HCC样本中免疫细胞的相对评分，并将每个细胞的生存曲线与最佳截断值相结合，以筛选与良好预后相关的免疫细胞，例如自然杀伤细胞（NK细胞）、M1巨噬细胞和活化的CD8 T细胞（图1D-F）。森林图显示这三种细胞类型的HR值均小于1，表明这些细胞类型是保护因素（图1G）。进一步进行Bootstrap重采样和多元Cox回归分析以构建TME评分。

糖基化相关预后基因的差异mRNA和蛋白质水平

利用qPCR方法比较了正常人肝细胞MIHA和高转移潜能HCC-LM3中15个基因的mRNA水平。结果显示，与MIHA相比，人肝癌细胞中CHP1表达较低，而PPIA、ALG3、CTSA、CAD、B3GAT3、TRAPPC3、HSP90AA1、SRD5A3、BAG2、DNAJC1、ADAMTS5、PLOD2、DYNC1LI1和ST6GALNAC4显著过表达（图2A）。此外，根据CPTAC数据库，在肿瘤组织中，CHP1的蛋白质水平表达较低，而PPIA、ALG3、CTSA、CAD、B3GAT3、TRAPPC3、HSP90AA1、BAG2、DNAJC1、PLOD2、DYNC1LI1和ST6GALNAC4显著较高。SRD5A3 蛋白表达在肿瘤和正常组织中无明显差异（图 2B）。本研究通过蛋白质印迹分析检测了 MIHA 细胞和 HCC-LM3 细胞中 15 种中心基因表达蛋白的表达情况，以进行比较。结果显示，与 MIHA 相比，HCC-LM3 细胞中 CHP1 表达较低，而 PPIA、ALG3、CTSA、CAD、B3GAT3、TRAPPC3、HSP90AA1、SRD5A3、BAG2、DNAJC1、ADAMTS5、PLOD2、DYNC1LI1 和 ST6GALNAC4 过表达（图 2C）。

图 2

GLY/TME评分在预测预后方面表现良好

训练队列中的患者根据相应的中位数分为高、低GLY组和TME组，以评估GLY分数和TME分数对HCC的预后能力。与低GLY分数患者相比，高GLY分数患者的OS明显更差（p <0.001）（图3A）。相反，高TME分数的患者生存期更长（图3B）。对高、低GLY分数组和TME分数组进行了通路富集分析。GSEA结果显示，高、低GLY分数组主要与脂肪酸代谢、色氨酸代谢、丁酸代谢和其他代谢途径有关（图3C）。免疫相关通路，如抗原加工和呈递以及原发性免疫缺陷，是高、低TME分数组中常见的富集通路（图3D）。

图 3

值得注意的是，本研究对来自两个个体的 HCC 生物样本的单细胞数据使用了 t-SNE 方法，并为每个细胞亚群生成了 GLY 分数，以进一步验证 HCC 单细胞转录组景观中的糖基化相关基因分数。利用已知的标记基因和文献中发表的注释，本研究鉴定了上皮细胞（CD24、KRT19、EPCAM）、恶性细胞（TTR、AMBP、APOH）、成纤维细胞（ACTA2、RGS5、TAGLN）、内皮细胞（PECAM1、VWF、CDH5）、巨噬细胞（CSF1R、CPVL、CD68）、肥大细胞（GATA2、KIT、CPA3）、浆 B 细胞（MZB1、JCHAIN、IGHG1）、B 细胞（MS4A1、BANK1、TNFRSF13C）、NK 细胞（NKG7、GZMK、PRF1）和 T 细胞（CD3G、CD2、CD3D）（图 3E）。本研究发现恶性细胞和上皮细胞的 GLY 评分高于免疫细胞（图 3F）。接下来，本研究试图确认 15 种预后相关基因在哪些细胞类型中高度表达。本研究发现，在单细胞水平上，这些预后相关基因主要在肿瘤相关细胞（如恶性肿瘤细胞和上皮细胞）中表达，但在免疫细胞中的表达水平很低（图3G）。

GLY/TME分类器的构建及预后价值评估

为了更好地探讨TME中免疫浸润细胞与糖基化相关预后基因的关联，本研究分析了糖基化相关预后基因与三种免疫浸润细胞的关系。相关性热图显示，除CHP1基因外，其余糖基化相关预后基因之间均呈显著正相关，而三类免疫细胞与这些预后基因呈负相关，说明GLY评分总体与TME相关（图4A）。基于免疫浸润高的细胞与糖基化修饰相关预后基因的显著相关性，本研究将GLY评分与TME评分结合起来进行预后评估。使用中位数将数据集分为GLYhigh/TMElow、GLYlow/TMEhigh、GLYhigh/TMEhigh和GLYlow/TMElow组。四个亚组的生存分析进一步显示，GLYhigh/TMElow亚组预后最差，GLYlow/TMEhigh亚组预后最好（图4B）。

图 4

此外，为了更好地了解GLY/TME评分系统是否能有效预测HCC患者的预后，绘制了差异最明显的两个亚组（GLYhigh/TMElow和GLYlow/TMEhigh）的ROC曲线。1、3和5年的AUC值分别为0.759、0.777和0.678，表明该评分系统可以很好地预测生存期（图4C）。为了进一步改进GLY/TME评分系统，本研究将预后差异较小的GLYhigh/TMEhigh和GLYlow/TMElow亚组合并为一个混合组，得到包含三种类型的GLY/TME分类器。生存分析显示，三种类型之间的预后状态存在显著差异，其中 GLYlow/TMEhigh 亚组仍然是 OS 最长的组（图 4D）。在训练队列中，通过单变量和多变量 Cox 回归分析对 GLY/TME 分类器的预后和预测意义进行了研究（图 4E ）。结果表明，GLY/TME 评分在单变量 Cox 回归分析中与 OS 相关，并与预后密切相关（p < 0.001），表明 GLY/TME 评分系统能够独立预测 HCC 患者的临床结果。

GLY/TME分类器中不同的潜在分子机制

使用“WGCNA”包检测4个亚群的特征基因。首先剔除异常样本，然后对剩余样本进行聚类，当β=11时，无标度R2为0.9，形成无标度网络（图5A）。接下来通过动态树切割获得8个共表达模块，并绘制聚类树状图（图5B），热图表示每个模块的特征基因邻接性（图5C）。此外，还测量了模块与4个队列的相关性。其中，蓝色模块与GLYhigh/TMElow亚群呈显著正相关，与GLYlow/TMEhigh亚群呈显著负相关。因此，本研究选取该模块的特征基因进行富集分析，结果显示该模块基因主要在细胞周期过程中富集，表明GLYhigh/TMElow亚群在细胞周期和增殖相关基因中富集程度非常高（图5D）。

图 5

为了探索这三个亚群特有的生物学特征，本研究利用“fgsea”包对DEG进行GSEA（图5E）。结果表明，GLYhigh/TMElow亚群主要参与循环核苷酸分解代谢过程、参与DNA复制的DNA链延长、脂肪细胞增殖、减数分裂I细胞周期过程、上皮-间质转化、血管发育调控、RNA聚合酶I转录、参与DNA修复的DNA合成、从RNA聚合酶II启动子转录延长的调控、以及对细胞周期G2/M期转变的正调控。同时，在GLYlow/TMEhigh亚群中，富集的通路主要包括对细胞大分子生物合成过程的负调控、有丝分裂G2 DNA损伤检查点信号传导、对有丝分裂细胞周期的负调控等过程，与GLYhigh/TMElow亚群的生物学过程呈拮抗作用。为了进一步探究三个亚群在GLY/TME分类器中的免疫状态，因此本研究使用TIP服务器算法对三类HCC患者样本的免疫活性进行了分析。最后，本研究可视化了三个亚群之间免疫相关通路的差异（图5F）。GLYlow/TMEhigh亚群患者的CD8 T细胞、NK细胞、T细胞和Th1细胞的募集分数高于GLYhigh/TMElow亚群。

高GLY分数与TME相关

下一步是确定 TME 中对糖基化活性有贡献的关键参与者。基于单细胞转录组数据 (GSE166635)，本研究之前确定了 10 个细胞亚群，包括 NK 细胞、浆 B 细胞、肥大细胞、巨噬细胞、内皮细胞、B 细胞、成纤维细胞、恶性细胞、T 细胞和上皮细胞。GLY 评分在恶性细胞亚群中的表达高于其他细胞。基于此，本研究根据 GLY 评分将恶性细胞亚群分为几组：GLYhigh 恶性细胞、GLYmedian 恶性细胞和 GLYlow 恶性细胞。为了表征三组 GLY 评分恶性细胞与其他细胞亚群的细胞间相互作用，本研究使用“CellChat”推断可能的细胞间相互作用信号作为配体-受体 (LR) 信号传导的功能。本研究检测到高 GLY 分数组中恶性细胞与其他细胞之间的相互作用增强，结果表明 GLYhigh 恶性细胞与成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞广泛交流，其次是 GLYmedian 恶性细胞，而 GLYlow 恶性细胞与其他细胞没有相互作用信息（图 6A）。这一发现表明 GLYhigh 恶性细胞有可能促成糖基化修饰表型。

图 6

然后本研究检查了高和低 GLY 分数的信号网络，以识别恶性细胞与其他细胞之间的单个 LR 对。其中，针对GLY高恶性细胞的成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞通过某些促肿瘤信号通路共同作用，包括NAMPT-(ITGA5+IAGB1)、SPP1(ITGA5+ITGB1)、NAMPT-INSR和TGFB1(ACVR1B+TGFBR2)信号对，它们相互作用，介导不受控制的肿瘤增殖和生长(图6B)。细胞粘附信号通路SPP1、趋化因子相关信号通路CCL15和CCL16、血管内皮生长因子VEGF信号通路和中期因子(MDK)信号通路是GLY高分恶性细胞向其他细胞类型分泌的主要信号因子(图6C)。其中，MDK信号通路据报道在HCC的发生和发展中起着重要作用[30]。此外，GLY 分数高的恶性细胞优先通过 SPP1 信号通路向巨噬细胞、内皮细胞和成纤维细胞发送信号，而 GLY 分数高的恶性细胞主要通过巨噬细胞接收该信号（图 6D）。总之，GLYhigh 恶性细胞可能比 GLYlow 恶性细胞与 TME 中的免疫细胞和基质细胞有更多的交流。

基于GLY/TME分类器的治疗预测

采用TIDE分析预测GLY得分亚组和TME得分亚组的HCC患者对免疫治疗的反应，探讨GLY/TME分类器在免疫治疗中的作用。结果显示，GLY得分低的个体对免疫治疗的反应优于GLY得分高的患者，提示他们可能从免疫治疗中获益更多。此外，相对于TME得分亚组，TME得分高的个体从免疫治疗中获益更多（图7A）。此外，34%的GLYlow/TMEhigh患者对免疫治疗有反应，而GLYhigh/TMElow组和混合组分别为25%和29%，且呈下降趋势（图7B）。此外，Proteomap还直观地揭示了GLY/TME分类器预测免疫治疗患者治疗反应的潜在机制。通过设置|logFC| > 0.5 且 adj.pval < 0.05，本研究筛选了 GLYlow/TMEhigh 和 GLYhigh/TMElow 亚组之间的差异上调基因以及免疫治疗反应和无反应亚组之间的差异上调基因。

图 7

比较了 GLYlow/TMEhigh 亚组和免疫治疗反应亚组之间的共同通路。令人惊讶的是，GLYlow/TMEhigh（图 7C）和免疫治疗反应组（图 7D）中上调和下调基因的 Proteomap 块非常相似。在未经治疗的 HCC 患者中，GLY/TME 分类器特征可能有助于预测患者对治疗的反应。还比较了两组的免疫检查点表达，因为免疫检查点对于有效的免疫治疗至关重要。如气泡图所示，26 个参与免疫检查点的基因与模型基因相关（图 7E）。PLOD2、ADAMTS5、ST6GALNAC4、DYNC1LI1、HSP90AA1 和 CAD 与免疫检查点基因显着相关。

GLYlow/TMEhigh和GLYhigh/TMElow亚组中治疗药物的益处

进行药物敏感性分析，分析GLYlow/TMEhigh患者在GLY/TME评分分类器中对化疗药物的敏感性与GLYhigh/TMElow患者相比，结果显示GLYhigh/TMElow患者对阿西替尼、PI3K抑制剂（AZD6482）、ERK抑制剂（VX-11e）、PLK抑制剂（BI-2536）更敏感，且药物疗效更好；相反，GLYlow/TMEhigh患者对唑来膦酸、Tankyrase抑制剂（XAV939）、WNT抑制剂（WNT-C59）、伏立诺他更敏感（图8A-H）。

图 8

小编总结

本研究使用受试者工作特征 (ROC) 和生存分析评估特征的可靠性，并使用外部数据集进行验证。此外，还研究了糖基化相关基因与免疫环境中其他细胞的相关性、GLY/TME 分类器的免疫特征以及免疫治疗的疗效。GLY 得分低/TME 得分高的亚组显示出良好的预后和治疗反应，这是基于免疫相关分子和癌细胞信号传导机制的显著差异。评估了 GLY/TME 分类器的预后作用，该分类器在治疗前显示出对预后和治疗反应的总体预后意义，这可能为为患者创造最佳治疗方法提供新的选择。