文献分享｜Nature Communications｜整合单细胞RNA测序与空间转录组学揭示人类胸腺的空间组织及T细胞发育动态

[ixxmu]

https://mp.weixin.qq.com/s/cGJrOF6SCGNg67a91CD3Iw

[ixxmu]

文献分享｜Nature Communications｜整合单细胞RNA测序与空间转录组学揭示人类胸腺的空间组织及T细胞发育动态 by 杨朝勇课题组

大家好！为大家介绍一篇2024年发表在Nature Communications的文章，题目为“Unraveling the spatial organization and development of human thymocytesthrough integration of spatial transcriptomics and single-cell multi-omicsprofiling”。本文中，作者通过整合空间转录组学和单细胞多组学分析，深入探讨人类胸腺细胞的空间组织和发育过程。研究中开发了名为TSO-his的工具，以实现对胸腺细胞的精确定位和动态变化的分析。本文的通讯作者是南京医科大学基础医学院李砚川教授，研究方向为重要信号转导通路在 B细胞命运决定和免疫应答中的分子机理研究。

01

背景介绍

胸腺对于 T 细胞发育至关重要，其小叶由皮质（C）和髓质（M）区域组成，可以促进发育中的 T 淋巴细胞的迁移。虽然已有研究揭示了 T 细胞发育的多种细胞类型和相关分子机制，但仍然缺乏对胸腺的空间图谱的全面研究。随着年龄的增长，胸腺会逐渐纤维化并萎缩，导致 T 细胞输出减少，增加罹患癌症、感染和自身免疫疾病的风险。因此，深入了解胸腺 T 细胞的起源、相互作用及其空间定位，具有重要的临床意义。为了突破以往研究在空间信息和单细胞分辨率方面的不足，本研究通过整合scRNA-seq和空间转录组学数据，开发了TSO-his和TSO-hismap工具，以单细胞分辨率揭示人类胸腺的组织结构，解析不同细胞类型在胸腺发育中的空间分布及其相互作用，探索T细胞发育过程中的动态变化。

02

设计思路

研究采用单细胞RNA测序（scRNA-seq）对16个不同发育阶段的胸腺样本（胎儿、儿童、成人和老年样本）进行分析，并结合空间转录组学数据，使用开发的TSO-his（组织结构转录组分割工具）对胸腺的皮质、髓质和皮髓边界进行分区。同时，利用TCR测序数据进一步分析T细胞受体链的动态发育。此外，通过CRISPR-Cas9介导的基因敲除实验验证了关键基因ELOVL4和CD99在T细胞发育过程中的作用。

图1. 实验流程示意图

03

数据介绍

作者对 16 个胸腺样本进行了 scRNA-seq，经过质量控制后，共获得 130,295 个高质量细胞，随后进行主成分分析 (PCA) 和无监督聚类。对B 细胞、髓细胞、基质细胞和 T 细胞进行第二轮聚类，从而揭示出 34 种不同的细胞亚型。研究发现，未成熟的T细胞亚群，如双阴性细胞（DN_early, DN_blast），在胎儿阶段占据主导地位，而成熟的T细胞（如CD4+ T记忆细胞和调节性T细胞）在成人和老年群体中更为丰富（图1f）。这些结果表明，胸腺的纤维化和老化影响了T细胞的发育，并与胸腺内细胞类型的空间分布变化有关。

图2 不同年龄段人类胸腺发育的转录图谱

作者基于 10X Genomics Visium 空间基因表达平台，对 8 个儿童胸腺样本（3 个月至 3 岁）进行 ST 测序，并开发了 TSO-his算法，用于分割胸腺 H&E 切片中的组织结构。作者将TSO-his 应用于 8 个胸腺组织 ST 切片，发现与髓质标记基因相关的评分在髓质区显著强调（图 3b）。此外， TSO-his准确检测到皮质区、髓质区、MC 边界和小叶等独特的解剖特征，这些特征与 H&E 切片中观察到的结构非常相似（图 3b、c）。通过使用聚合表达谱的 Pearson 相关性对 ST 切片中的结构区域进行聚类，可以清楚地区分八个样本的小叶中的髓质区和皮质区（图 3d）。综上所述，TSO-his 能够识别胸腺切片的髓质区和皮质区，并能分割其小叶。这些结果为了解胸腺微环境中 C-MC-M 空间轴上细胞类型的动态变化提供了重要见解。

图3胸腺空间转录组学（ST）切片中关键区域的识别

接着，作者使用 TSO-his 工具筛选 C-MC-M 轴上的显著距离变化基因 (DVG)。结合八个 ST 样本，鉴定出 1885 个 DVG（p  ≤ 1%），包括髓质标志物（标记为红色）和 T 细胞发育的经典阶段标志物（标记为绿色），这些基因的层次聚类揭示了不同区域特定通路的富集（图 4a）。此外，作者还探究了髓质和皮质区 DVG 与差异表达基因（DEG）的关系，发现二者有大量重叠（图 4b、c）。利用 TSO-his，作者确定皮质和髓质区表达最突出的前五个基因（图 4d）。其中，CCL19 是髓质中上调最显著的基因，在mTEC中特异表达，其配体CCR7在成熟 T 细胞中高表达，证实CCL19-CCR7 协同引导成熟 T 细胞从胸腺迁移至外周血（图 4e）。ELOVL4 和 CD99 在皮质区域表达显著升高，其中在 DP 阶段更为显著（图 4f）。重要的是，与DP_blast 相比，DP_re 中 ELOVL4 和 CD99 表达显著上调，这与 TCR α 链相关基因的表达模式一致（图 4g、h）。此外，作者研究了不同年龄组中 ELOVL4 和 CD99 的表达与 TCR α 链表达的关系。研究发现，二者表达模式与 TCR α 链波动极为相似，并且在老年人中呈明显下降趋势（图 4i、j）。这种下降可能由于衰老胸腺的退化和萎缩致使功能减弱。另外，通过相关性分析，证明了 ELOVL4 和 CD99 的表达与 TCR α 链之间存在强烈正相关关系（图 4k）。

图4 探索胸腺 T 细胞发育和分化中的空间基因表达模式和功能

接下来，作者为明确这些基因的作用，作者分离了不同发育阶段的小鼠和人类中胸腺细胞，并在蛋白水平，检测了ELOVL4 和 CD99 的表达量。分析显示，ELOVL4 和 CD99 在 DP_re 阶段表达富集，与相应 RNA 表达谱相符（图 5a-c）。为进一步验证 ELOVL4 和 CD99 的功能，作者采用CHimeric IMmune Editing 方法，借助 CRISPR - Cas9 骨髓递送系统快速评估基因功能（图 4d）。在嵌合小鼠中，ELOVL4-KO骨髓来源的胸腺CD4+ T细胞频率显著下降，而在CD99-KO 骨髓中无明显变化（图5e-h、l-o）。通过ELISA 和 3H-胸苷掺入试验可证明，ELOVL4的缺失会使白细胞介素 2（IL-2）和干扰素-γ（IFN-γ）等细胞因子产生减少，且幼稚 CD4+ T 细胞在 TCR + CD28 刺激后增殖降低（图 5i、j）。相反，CD99 的缺乏对该过程无明显影响（图 5p、q）。此外，分析 Treg 群发现，野生型（WT）和 ELOVL4-KO 组 Treg 百分比无显著差异，但 ELOVL4-KO 组 Treg 数量减少可能因总 CD4+ T 细胞损失（图 5k）。这些结果证实 ELOVL4 是控制 CD4+ T细胞成熟和活化的新型调节剂。

图5 利用 CRISPR/Cas9 介导的敲除技术研究胸腺发育中皮质区域富集基因

鉴于 ST 技术分辨率有限，其斑点仅代表多个细胞的基因平均表达。因此作者开发了 TSO-hismap 工具，该工具可通过 TSO-his 和空间反卷积工具 CARD整合 scRNA-seq 和 ST 数据，以单细胞分辨率重建胸腺空间图谱（图 6a）。为评估 TSO-hismap 性能，作者结合已知细胞类型位置，在不同噪声水平下模拟胸腺 ST 数据。此外，作者用 TSO-hismap 和其他工具将胸腺单细胞投影到 8 个真实 ST 切片（图 6c）。为进一步比较 TSO-hismap 和 CARD 性能，作者用 Sankey 图可视化皮质和髓质区域中每种细胞类型的相对比例（图 6d）。结果表明，与 CARD 相比，TSO-hismap 所得结果与胸腺细胞类型定位研究更相符。此外，作者比较 scRNA-seq 数据中观察到的细胞类型相对丰度与投影到空间坐标后所得的相对丰度，发现 TSO-hismap 相关性最高（R  = 0.99。综上，TSO -hismap 可在单细胞分辨率下准确重建不同胸腺细胞类型的空间分布）。

图6 正常胸腺的单个细胞到空间坐标的投影

04

总结

本研究通过整合空间转录组学和单细胞多组学分析，成功揭示了人类胸腺细胞的空间组织和发育过程。开发的TSO-his工具为理解胸腺微环境在T细胞发育中的作用提供了新的视角，识别了ELOVL4作为CD4+ T细胞阳性选择的关键介质。这些研究结果不仅加深了对胸腺生物学的理解，也为未来的免疫治疗和相关疾病的研究提供了重要的数据资源和理论基础

05

原文链接

https://doi.org/10.1038/s41467-024-51767-y

撰稿人：Di Wang

校稿人: Kun Yin

推送：Kun Yin

Yang's lab

课题组网站

http://www.yang-lab.com

点击“阅读原文”，可直达文献