易复现生信思路--单基因与冠状动脉疾病相关研究

易复现生信思路--单基因与冠状动脉疾病相关研究 by 作图丫

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导语：易损斑块与复发性心血管事件相关。本研究旨在探索冠状动脉疾病患者易损斑块的预测生物标志物。

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背景介绍

今天小编为大家带来的这篇文章，作者揭示易损斑块发展中与表型相关的细胞类型并识别病理过程的中心基因。文章发表在《Frontiers in lmmunology》上，文章题目为：Serum secreted phosphoprotein 1 level is associated with plaque vulnerability in patients with coronary artery disease。

研究设计

本研究技术路线如图1所示。

图 1

数据介绍

共从上海瑞金医院经皮冠状动脉介入治疗结果项目数据库纳入了 2020 年 1 月至 2022 年 12 月期间接受诊断性冠状动脉造影和 IVUS 治疗的 1751 名连续冠状动脉疾病患者。

结果解析

单细胞RNA测序的数据预处理

我们下载了包含三个人类斑块样本的 GSE155514 数据集。使用 R 包 Seurat 进行数据预处理。质量控制后共鉴定出 4519 个细胞。然后，我们根据先前的研究和 R 包 SingleR 对细胞簇进行注释，并使用 T-SNE 图进行可视化。总体而言，我们根据其表达基因水平鉴定出十二个细胞簇，包括六个非免疫簇和六个白细胞簇（图 2A）。前者包括3个内皮细胞簇、1个平滑肌细胞簇、1个成纤维细胞簇、1个纤维软骨细胞簇和1个中间细胞状态簇（介于SMC和FC之间），而后者包括1个T细胞簇、1个浆细胞簇、1个肥大细胞簇和3个巨噬细胞簇。定义这些细胞簇的标记如图2B所示。

图 2

为了进一步了解斑块中的细胞在易损斑块发展中的作用，我们使用 R 包 Scissor 整合了大量 RNA-seq 和单细胞测序数据。通过利用大量表达矩阵和临床信息，我们成功鉴定出264个表型相关细胞，其中165个为Scissor+（细胞与易损斑块呈正相关（图2C）。巨噬细胞.1占大多数，而巨噬细胞.2和巨噬细胞.3占少数。血管平滑肌细胞、中间细胞状态和纤维软骨细胞形成Scissor-细胞簇。为了揭示与易损斑块相关的已鉴定细胞的潜在转录模式，我们比较了Scissor+细胞簇和Scissor-细胞簇之间的基因表达。总共检测到1240个显着上调的基因和1055个显着下调的基因（图2D）。SPP1在差异表达基因中表现出最显着的变化，表明其在与巨噬细胞相关的易损斑块发展中具有潜在作用。GO富集分析显示Scissor+细胞簇主要参与炎症过程，例如中性粒细胞活化、t细胞活化、细胞因子产生以及白细胞黏附或分化（图2E）。KEGG富集分析进一步证实了炎症相关信号通路（NF-kB、Nod样受体、TNF信号通路）的上调，这与巨噬细胞的分子功能一致。此外，发现Scissor-细胞簇主要参与细胞外基质组织和肌肉系统过程。通路富集分析表明PI3K-akt、MAPK和TGF-β信号通路显著富集并与Scissor-细胞簇相关（图2F）。因此，我们通过Scissor对单细胞RNA和RNA测序数据的整合分析，确定了与易损斑块发展最相关的细胞亚群，并强调了Scissor+/-细胞簇在易损斑块形成中的关键作用。

细胞间通讯网络建立

细胞间通讯错综复杂，在易损斑块形成中起着关键作用。为了描述细胞簇的细胞通讯，尤其是与表型相关的细胞通讯，我们使用 R 包 CellChat 分析并推断了通讯网络，该包包含一个手动整理的配体-受体数据库，称为 CellChatDB，并允许用户分配细胞标签输入。我们使用圆形图显示总细胞簇中相互作用的数量和强度，结果表明这些细胞簇之间存在复杂的相互作用（图 3A）。为了进一步了解这些细胞簇之间的输入和输出信号模式，使用热图来描述潜在的信号通路。我们的结果表明，Scissor+ 细胞簇而不是 Scissor- 细胞簇充当了激活的信号发送者和接收器（图 3B）。值得注意的是，发现 SPP1 信号是最突出的输出信号通路（图 3C），而 BTLA 信号是最显著的输入信号通路（图 3D）。此外，我们发现Scissor+细胞簇是唯一发送SPP1信号与多种细胞类型相互作用的细胞簇，包括非免疫细胞（内皮细胞、纤维软骨细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和ICS细胞）和T细胞。重要的是，由于ICS细胞簇代表了FC和VSMC之间的中间状态，我们的结果表明SPP1信号可能显着影响平滑肌细胞表型转换。综上所述，这些观察结果强调了表型相关细胞的SPP1信号在斑块不稳定性中的重要作用。

图 3

通过WGCNA识别关键模块和基因

我们应用WGCNA方法，利用GSE28829数据集中的表达谱和临床信息探索疾病的共表达基因。选择表达方差较大的前5000个基因进行分析。在构建加权共表达网络之前，我们删除了一个样本（GSM714096），因为它的聚类不正确。我们发现当功率值设置为18时，尺度独立性> 0.90，平均连接性更高。接下来，我们使用层次聚类树建立了共表达模块以供进一步分析。通过其独特的颜色识别出12个模块，这些模块中的基因数量从93到962不等。灰色模块代表没有相似表达模式的基因，被淘汰以供进一步分析。结果显示，绿松石模块中的基因与易损斑块的发生最显着相关（图4A）。散点图显示，97个共表达基因与绿松石模块中的易损斑块性状高度相关，模块成员数> 0.8，基因显着性> 0.7（图4B）。通过将共表达基因和单细胞 RNA 测序数据集中的 DEG 结合起来，获得了 83 个中心基因（图 4C）。GSE155514 和 GSE28829 数据集中差异最大的基因分别如图 4D、E 所示。根据 DEG 和细胞间通讯分析，我们发现 SPP1 是最突出的基因。总之，我们确定并验证了青绿色模块中的 SPP1 是易损斑块发生的最重要基因。

图 4

在患者队列中进行中心基因验证

为了探讨SPP1在临床实践中的潜在作用，我们从上海瑞金医院经皮冠状动脉介入治疗结果项目数据库中招募了接受冠状动脉造影和IVUS检查的患者。共有593名患者符合纳入标准（图1B）。IVUS 发现不稳定斑块患者的 SYNTAX 值较高 (12.38 ± 7.14 比 9.17 ± 5.16; P < 0.001)，Gensini 评分较高 (25.13 ± 17.41 比 16.82 ± 11.79; P < 0.001)，年龄较大 (65.24 ± 10.31 比 61.98 ± 10.09; P < 0.001)，且血清 SPP1 水平较高 (113.21 [73.6 - 147.70] ng/ml 比 71.08 [20.64 - 135.68] ng/ ml; P < 0.001)，与稳定斑块患者相比 (图 5)。

图 5

两组在性别、体质指数、吸烟史、高血压、既往心肌梗死和糖尿病、血压、肾功能、血脂谱、斑块负荷和药物治疗方面均无显著差异（所有 P > 0.05）。在相关性分析中，血清 SPP1 水平与斑块负荷（r = -0.010，P = 0.804）或最小管腔面积（r = -0.501，P = 0.219）之间无显著相关性。受试者工作特征曲线分析显示，血清SPP1预测患者不稳定斑块的曲线下面积为0.643（95%CI，0.603-0.681；P<0.001），最佳截断点为64.354ng/ml（敏感性=79.36%，特异性=47.85%）（图6A）。此外，在调整常规危险因素的模型中，受试者工作特征曲线显示，加入SPP1可有效提高AUC（图6B-D）。将 SPP1 纳入 Gensini 评分作为常规风险因素的模型中，显示出最佳 AUC（AUC = 0.737，95% CI，0.697 - 0.773；P < 0.001），与常规风险因素模型相比，C 统计量显著 0.061（95%CI，0.022 - 0.099；P = 0.002）。