vianamares
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3 years ago Engineered ACE2 receptor traps potently neutralize SARS-CoV-2 Resumo:
- variantes ACE2 otimizadas por afinidade e enzimaticamente inativadas
- optimized receptor traps:otimizados devido às modificações na ordem dos aminoácidos pelos que apresentam menor grau de entropia gerando uma maior interação do domínio da peptidase da ACE2 com a spike
- O design da interface ACE2 – RBD foi feito usando um processo de design de backbone de proteína flexível de dois estágios gerando maior afinidade da RBD
Introdução: vantagem potencial de que a resistência viral a uma armadilha do receptor ACE2 também inibiria a capacidade do vírus de entrar por meio da ligação ao receptor de entrada ACE2 usando uma abordagem de engenharia de proteína híbrida computacional e experimental eles melhoraram a afinidade de ligação da ACE2 c/ o RBD da Spike
Resultados:
- -crystallizable fragment (Fc)
- caracterizaram as afinidades de ligação das variantes ace2 projetando computacionalmente elas como fusões FC para a RBD da Spike em ensaios BLI usando proteínas purificadas
- Testaram a ligação do RBD com a H34V / N90Q / H374N / H378N ACE2 (614) -Fc para determinar o impacto da remoção de um glicano adjacente à interface em N90, e como a atividade de peptidase nativa da proteína. -> essas proteínas mostraram ser 10x melhores que a WT
- Fizeram fusões c/ Aga2p para exibição na superfície em células de levedura
- Tiraram o domínio Fc para evitar efeitos de avidez
- H34V, N90Q, H34V/N90Q, and K31F/H34I/E35Q variantes usadas para modelos iniciais
- Variantes + myc tag + Aga2p + C-terminal com GFP melhorada
- A “stringency” foi aumentada em cada rodada de exibição de levedura para enriquecer a população de células para variantes de ACE2 (614) que ligavam fortemente o RBD. Usaram as classes de equilíbrio com concentrações decrescentes de RBD para as classificações de 1 a 3, e as classes das taxas de desativação com tempos de dissociação crescentes e diminuição do tamanho do portão foram usadas para as duas últimas classificações 4 e 5.
- Confirmaram a ligação usando o RBD-Fc da spike biotinilado e estreptavidina Alexa Fluor 647, gerando a expressão da GFP e impedindo a expressão da Myc-tag
- Realizaram os tipos de aumento de rigor usando diferentes concentrações de monômero RBD
- As leveduras mutantes tinha afinidades de 0,52, 0,45, 0,19 e 0,12 nM
- DMS experiment of Procko identifica pontos benéficos nas modificações da interface da ACE2-RBD
- os três RBDs do trio da spike podem ligar-se independentemente na
- ACE2
- As fusões Fc da WT ACE2 que continham o domínio da colectrina se mostraram recentemente mais eficazes no bloqueio da infecção viral
- The highest-affinity mutants from our yeast display campaign were poorly expressed as Fc fusions, indicating that despite numerous reports of stabilizing mutations from yeast display, ACE2 variant expression on yeast did not translate to well-folded soluble protein (37, 38)
- inativaram a atividade de peptidase de ACE2 para maior estabilidade e evitar vasodilatação
- as mutações ACE2 do projeto+domínio da colesterina+fusão com o domínio Fc >melhora significativamente a neutralização sobre ACE2(740 )não modificada
- As variantes 293, 310 e 313 diminuíram consideravelmente o RNA viral (310,313*)
- usando as concentrações do ensaio de neutralização não se apresentou citotoxicidade induzida
- domínio de colectrina e o domínio humano IgG Fc > a potência de neutralização
- o uso de H345L ACE2 (740) -Fc é é essencial para a neutralização devido a dimerizaçao
Colocar um resumo ou as partes mais importante do abstract (4 linhas máx.) dos seguintes artigos:
[ ] P. Zhou et al., A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature 579, 270–273 (2020).
[ ] J. Huo, A. Le Bas, R. R. Ruza, H. M. E. Duyvesteyn, Neutralizing nanobodies bind SARS-CoV-2 spike RBD and block interaction with ACE2. Nat. Struct. Mol. Biol. 27, 846–854 (2020).
[ ] I. Lui et al., Trimeric SARS-CoV-2 spike interacts with dimeric ACE2 with limited intra-spike avidity. https://doi.org/10.1101/2020.05.21.109157 (21 May 2020).
[ ] A. C. Walls et al., Structure, function, and antigenicity of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein. Cell 181, 281–292.e6 (2020).
[ ] J. Lan et al., Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature 581, 215–220 (2020).
[ ] T. Kortemme, D. Baker, A simple physical model for binding energy hot spots in protein–protein complexes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14116–14121 (2002).
[ ] N. Ollikainen, M. R. de Jong, T. Kortemme, Coupling protein side-chain and backbone flexibility improves the re-design of protein-ligand specificity. PLoS Comput. Biol. 11, e1004335 (2015).
[ ] Y. Li et al., Potential host range of multiple SARS-like coronaviruses and an improved ACE2-Fc variant that is potent against both SARS-CoV-2 and SARS-CoV-1. http://biorxiv.org/lookup/doi/10.1101/2020.04.10.032342 (11 April 2020).
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[ ] L. T. Dang et al., Receptor subtype discrimination using extensive shape complementary designed interfaces. Nat. Struct. Mol. Biol. 26, 407–414 (2019).